大鼠脊髓损伤后神经连接蛋白1的表达①

郭永强，赵鑫，陈铁戈，张东亮，王明，汪静，李森，王海燕，伍亚民，张海鸿

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州市730030；2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州市730030；3.陆军军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042

脊髓损伤会引起肢体运动、躯体感觉以及内脏活动等一系列功能障碍，对患者家庭以及社会造成严重负担[1]。促进脊髓损伤后突触再生有助于提高机体相关功能恢复[2-3]，改善预后。

神经连接蛋白(neuroligins,NLs)家族作为突触后一类细胞黏附分子，与突触前轴突蛋白结合，形成跨突触的复合结构[4-5]。NLs在神经系统发育早期具有调节突触形成的作用[6]，后期则主要影响神经元兴奋性[7]。NL1是目前研究最为清楚的NLs家族成员。研究发现，除参与形成兴奋性突触后结构外，NL1还与突触发生形成以及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体形成有关[8-12]。NL1既是形成突触的结构蛋白，也是影响突触发生形成以及信息传递的功能蛋白。

本实验研究动态检测大鼠脊髓损伤后NL1表达的变化，为进一步研究脊髓损伤后突触再生及其相关影响因素提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级成年雌性Sprague-Dawley大鼠60只，体质量(200±10)g，由陆军军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供。采用随机数字法，将动物编号后等分为假手术组和实验组，再用随机数字法将两组大鼠按照术后时间等分为3 d、7 d、14 d、21 d和28 d五个亚组。实验大鼠依照实验动物相关福利与伦理原则进行处理。

1.2 主要试剂和仪器

NL1抗体(H-45,OM160293)：OMNIMABS公司。Alexa Flour 647标记山羊抗兔(H+L,A0468)：碧云天生物技术有限公司。FD快速Golgi-Cox染色试剂盒：美国NEUROTECHNOLOGIES公司。OCT冰冻切片包埋剂：美国SAKURA公司。Triton X-100、DAPI和Tween 20：SIGMA公司。RM2007 Allen打击器：美国新泽西州大学。冰冻切片机和SP-2激光共聚焦显微镜：德国LEICA公司。

1.3 模型制作

动物常规术前准备。1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，待大鼠角膜反射消失后，背部剃毛备皮，俯卧位固定于鼠板上。定位标记T10(两耳尖连线向尾端三横指处)，碘伏棉球擦拭消毒备皮术区。以T10标记为中心，做长约3 cm纵形切口，逐层分离皮下筋膜及肌肉组织，暴露并切除T9-11椎板，充分显露T10节段脊髓。操作过程中不能损伤脊髓并保证硬脊膜完整。

将实验组大鼠固定到Allen打击器上，调节打击棒末端以对准T10节段脊髓，打击力度设置为10 g×25 mm，按打击按钮完成脊髓打击。打击成功的标志为大鼠双下肢痉挛性抽搐，尾巴翘起摆动后倒下，被打击部位脊髓立即出现充血水肿。

两组大鼠均以无菌生理盐水冲洗手术切口，逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤，碘伏棉球擦拭消毒手术切口。术后腹腔注射青霉素每天16万U，共3 d。恢复自主排尿前，每天按压膀胱协助排尿，早中晚各一次。

1.4 后肢运动功能评分

分别于各时间点，由2名以上熟悉BBB评分方法的非本实验组人员，对大鼠行BBB评分。大鼠放入旷场让其爬行，观察髋、膝和踝关节的运动情况，以及躯体运动的协调情况。实验组大鼠如术后1 d和3 d评分偏离平均值≥2分者予以剔除，及时造模补缺。

1.5 Golgi-Cox染色

取材前1 d将A、B液等体积混合并避光保存。每组取3只大鼠，1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后活取脊髓，双蒸水漂洗后浸入A、B混合液中，24 h后换液，室温下避光放置2周。将组织转移至C液中，次日换液，4℃避光放置72 h。吸水纸吸干组织表面液体，少量OCT包埋剂包埋后，置-80℃冰箱中速冻。冰冻切片机纵切片，厚60μm。组织切片贴在涂有C液、经明胶包被的载玻片上。避光风干24 h后双蒸水冲洗两次，每次4 min。将切片浸入D液、E液和双蒸水比例为1∶1∶2的混合液中10 min；再依次浸入50%、75%和95%乙醇中脱水，每个梯度4 min；无水乙醇中脱水4次，每次4 min。二甲苯透明3次，每次4 min，高浓度树脂封片剂封片。10×40倍镜下观察脊髓损伤中心上端白质中树突，10×100倍油镜下计数10μm长度内树突棘数。

1.6 免疫荧光染色

每组取3只大鼠，1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，分别用0.01 mol/L PBS 200 ml和4%多聚甲醛溶液200 ml经左心室灌注固定。以脊髓损伤部位为中心，远端和近端各延长5 mm截取脊髓，浸入4%多聚甲醛溶液4℃冰箱固定24 h后，转移含30%蔗糖0.01 mol/L PBS中脱水，待沉底后取出。OCT包埋剂包埋后，置-80℃冰箱速冻。冰冻切片机连续切片，厚20μm。贴片后室温自然风干30 min，置-20℃冰箱中备用。

切片室温复温30 min，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；0.3%Triton X-100破膜30 min；0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；5%正常山羊封闭血清封闭20 min；吸弃封闭液，吸水纸吸干，滴加NL1一抗(1∶20)，4℃冰箱孵育过夜；室温复温，吸弃一抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；吸水纸吸干；滴加Alexa Fluor 647荧光标记山羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育1 h；吸弃二抗，含0.2%Tween 20的0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；滴加DAPI(10 mg/L)，常温避光反应3 min。吸弃DAPI，吸水纸吸干，抗荧光淬灭剂封片。选择实验组各时间点损伤区域上段位置相对统一且组织结构完整的切片，同时选择假手术组相同脊髓节段切片，激光共聚焦显微镜200倍下扫描成像，拍照。Image J1.50i软件计算平均光密度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。结果均用(xˉ±s)表示，假手术组与实验组比较均采用独立样本t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 后肢运动功能评分

实验组术后3 d双后肢基本无自主活动；术后7 d髋、膝关节活动有所恢复，踝关节及趾跖关节均无活动；术后14 d髋关节已能广泛活动，膝、踝关节轻微或广泛活动；术后21 d髋、膝及踝关节已能广泛活动，同时伴有爪背面支撑移动或爪掌面着地；术后28 d除髋、膝、踝关节自主广泛活动外，已普遍可以用爪掌面承重移动，但与前肢活动的协调性较差，且躯干明显不稳。

假手术组术后各时间点髋、膝、踝及趾跖关节活动均正常。术后3 d部分大鼠有活动时躯干不稳现象，但术后7 d基本恢复正常。

术后各时间点，实验组BBB评分均显著低于假手术组(P＜0.001)。见图1。

图1 各组大鼠BBB评分比较

2.2 Golgi-Cox染色

400倍光镜下，各组损伤区上段结构完整，大致同一区域白质中树突变化见图2。与假手术组相比，实验组术后3 d及7 d树突减少不明显，术后14 d、21 d和28 d树突逐渐稀疏。

1000倍油镜下各组树突棘变化见图3。与假手术组相比，脊髓损伤后树突棘密度随时间进展逐渐降低(图 4)。

2.3 免疫荧光染色

与假手术组相比，实验组术后3 d NL1荧光信号开始增强，至术后14 d时最强；随后逐渐减弱；术后28 d时仍高于假手术组(图5、图6)。

图2 假手术组及实验各组树突形态(Golgi-Cox染色,bar=20μm)

图3 假手术组及实验各组树突棘形态(Golgi-Cox染色,1000×)

图4 各组大鼠树突棘密度比较

图5 各组大鼠NL1免疫荧光平均光密度比较

图6 假手术组及实验各组NL1表达(免疫荧光染色,200×)

3 讨论

脊髓损伤后突触再生与重塑有助于神经功能恢复。突触形成是一个包括多步骤的复杂过程，存在很多影响因素[13-14]。由于神经系统再生能力差，且损伤后大量星形胶质细胞被激活导致胶质瘢痕增生，以及小胶质细胞和巨噬细胞激活引发神经炎症反应，使脊髓损伤后突触再生受到限制[15-17]。脊髓损伤后，由于血-脊髓屏障被破坏，大量血管活性肽、细胞因子以及炎症细胞进入脊髓组织[18]，进入组织的炎症趋化因子可以通过与其受体结合，影响突触形成[2]。NL1作为形成兴奋性突触的结构蛋白和功能蛋白，在突触形成和发生过程中发挥重要作用。

NL1是由神经元合成的突触后跨膜蛋白，在细胞内与兴奋性突触后膜上的突触后致密蛋白质95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)通过-C端PDZ结构域结合序列相结合[19]，且与桥尾蛋白通过胞内结构域中部的一致性序列相结合[20]；同时NL1与突触前轴突蛋白-1β通过细胞外结构域相连接[21]。NL1与轴突蛋白-1β在突触发生和成熟过程中发挥重要作用[22]。既往研究表明[9-12]，NL1在神经元中过表达，可促进突触生成；NL1被沉默时，突触数量减少。

树突棘作为构成突触后成分的特异性结构，其密度和结构改变可间接反映脊髓损伤后突触修复情况[23]。本研究显示，脊髓损伤后，树突和树突棘密度呈持续下降趋势，而NL1的表达则呈先增高后降低的趋势。由于NL1由神经元合成，而脊髓损伤后有大量神经元坏死和凋亡，导致树突和树突棘密度降低；而在损伤后28 d内，NL1的表达都高于假手术组，NL1表达的升高并未与树突及树突棘密度的变化趋势一致，提示NL1并未对突触再生发生影响。另一方面，由于NL1是一种结构和功能蛋白分子，即使NL1参与脊髓损伤后突触再生，树突棘密度在短期内的变化并不能充分反映突触再生情况。脊髓损伤后NL1对于突触再生的影响还需进一步研究。

Xu等[24]发现，NL1是血小板反应蛋白-1促进突触生成的效应分子；而血小板反应蛋白-1在小鼠大脑损伤后表达升高，且是损伤后神经功能恢复所必需[25]。本实验发现NL1在大鼠脊髓损伤后28 d内表达都高于假手术组，但这一变化不足以引起损伤脊髓的突触再生。其机制有待进一步研究。

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