青春双歧杆菌的波状层次生长特征观察

刘俊康， 邓 渝, 郭林明

(第三军医大学药学系 生药学与天然药物化学教研室，重庆 400038)

生物波研究较早地提出了生物耗散与生态统一机制等生物波动生长机制[1]，逐步促成了条件论的理论进展[2]。在此理论指导下，研究了体外培养绿脓杆菌生长的层次状结构[3]、变形杆菌、酵母菌、大肠埃希菌等的波状层次生长特点[4]，以及人膀胱癌细胞的波状层次生长特征[5]，但作为厌氧菌种类的青春双歧杆菌，其在体外培养，能否在生长过程中形成波状层次的结构及对青春双歧杆菌的生长、生存的意义研究较少，作为肠道重要的生理菌群，深入研究青春双歧杆菌在各种环境条件下的生长特性、生存方式，以此创造更利于双歧杆菌生长的条件，保持肠道微生态平衡具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)，本实验室保存。

1.1.2 培养基、菌种稀释液及厌氧指示剂 ①改良BS 培养基：多胨18 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉0.5 g，吐温-80 1 g，L-盐酸半胱氨酸盐酸盐1 g，A液10 mL,B液15 mL，牛肝浸液150 mL，牛脑浸液312.5 mL，牛心浸液462.5 mL，琼脂20 g，上述成分溶于超纯水，定容至1 000 mL。调pH值至7.2～7.4，分装，115 ℃无菌灭菌20 min。A液配方：K2HPO42.5 g,KH2PO42.15 g,超纯水25 mL；B液配方：MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,NaCl 0.05 g,MnSO40.033 7 g,超纯水25 mL。牛脑、牛肝、牛心浸液制备方法：去筋膜，剪碎组织(约1 ～2 mm3)，称重加双倍量水(即500 g组织加1 000 mL水)浸泡过夜，去掉表面油脂，45 ℃预热1 h，100 ℃水浴锅加热1 h后8层纱布过滤，-20 ℃冰箱保存。②菌种稀释液：KH2PO44.5 g，Na2HPO46 g，L-盐酸半胱氨酸盐酸盐 0.5 g，吐温-80 0.5 g，琼脂1 g，超纯水定容至1 000 mL，115 ℃无菌灭菌20 min，备用。③厌氧指示剂：硼酸二钠溶液(Na2B4O7·10H2O 2.5 g，美兰25 mg，酚红1 mg，超纯水400 mL，以上成分混合溶解后，用5 mol/L NaOH溶液调pH值至9.0，备用)与琼脂溶液(琼脂0.625 g，超纯水250 mL)分别加热煮沸，混匀，分装安瓿。每安瓿装1 mL左右，趁热(溶液为红色)熔封安瓿。分装的指示剂在使用前加热至蓝色消失，即可急速冷却后放入厌氧环境。

1.1.3 仪器与设备 Olympus多功能显微镜BX41，日本Olympus公司；原子力显微镜SP13800N-SPA400，日本精工公司；柯达数码相机Kodak Easyshre V603，3倍光学变焦；厌氧培养罐，本室自行设计专利产品；冰箱，海尔公司；恒温培养箱HH.BII500-BS，上海跃进医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养及菌液制备 将受试菌在BS改良培养基平板上多次转种以保证其纯度及选出生长旺盛、相变能力强的菌株。用菌种稀释液制成菌悬液，并调整其浊度，稀释至1×103个/mL的细菌悬液，取50 μL均匀涂布于BS平板上，37 ℃厌氧环境中(80%N2、10%H2和10%CO2，体积分数)连续培养6 d，平板上长出10～15个菌落，菌落直径为2.5～3 mm(该菌转种可正常生长)。平板取出后装入原有包袋中并密封，一部分4 ℃冰箱久置，另一部分室温放置。

1.2.2 菌体形态观察 用革兰染色法观察菌体形态。

1.2.3 原子力显微镜样本收集与检测 从菌落半透明环处取细菌标本，用无菌生理盐水稀释，制成200 μL 细菌悬液。吸取少量细菌悬液，小心滴于专用玻片上干燥，以甲醇固定15 min，蒸馏水漂洗3次，每次1 min。待干后用原子力显微镜在室温大气环境中对青春双歧杆菌球形体细菌形态特征进行扫描观测。图像均在轻敲模式(tapping mode) 下获得，探针为SIAF01(微悬臂长200 μm，弹性系数0.12 N/m)，力常数为0.2 N/m，扫描参数为X: 115 μm、Y:115 μm、Z:29.97 μm。按照原子力显微镜操作程序扫描观测该处青春双歧杆菌。

2 结果与分析

2.1 平板菌落观察

青春双岐杆菌菌落在4 ℃冰箱久置2～4周，部分菌落先后出现了半透明和透明的明暗交替的序性同心圆环状结构，明暗交替3～4次，如图1A；在菌落凹陷处可见透明环，如图1B。而在室温放置2～4周的青春双歧杆菌菌落，表面光滑呈土丘状，未出现明暗交替序性同心圆环状结构。

图1 青春双歧杆菌菌落形态Fig.1 Colony form of Bifidobacterium adolescentis

2.2 革兰染色观察青春双歧杆菌

在青春双歧杆菌同心圆环由内到外的不同位置取细菌标本，在光学显微镜下观察到由于培养时间较长，部分菌体革兰染色红色假阴性。不同取菌部位，菌体形态有明显的区别。菌落中不透明圆环处所取标本的青春双歧杆菌形态有两种，一种是染成紫色的球形体，一种是染成红色的正常形态，如图2A；菌落半透明凹陷环处所取标本，青春双歧杆菌形态组成有三种，一种是染成紫色的球形体，且其比例较图2A更多，一种是正常形态的菌体相变成串珠样染成紫色的球形体，第三种是少量的正常的菌体形态，如图2B。

图2 青春双歧杆菌革兰染色结果

2.3 原子力显微镜扫描观察青春双歧杆菌形态

通过原子力显微镜扫描方法，观察到青春双歧杆菌在改良BS 培养基上菌体从杆状变成了串珠状球形体(图3A)，其直径在1～2 μm(图3B)，观察球形体表面，发现菌体表面粗糙不平(图3C)。

图3 原子力显微镜扫描青春双歧杆菌结果Fig.3 Atomic force microscope scan results of Bifidobacterium adolescentis

3 讨 论

在有关细菌等波状层次生长特征的研究基础上[6]，本研究发现作为严格厌氧菌的双岐杆菌生长的波状层次结构。近年来环境压力导致的细菌菌体形状改变研究较多，例如幽门螺杆菌在氧胁迫下的球形变异[7]，以及奇异变形杆菌在抗生素条件下的球形变异[8]等。青春双歧杆菌在波状层次生长过程中也出现了菌体多点断裂增殖的现象，产生了球形体，这与之前在青春双歧杆菌菌落的自溶环内出现了球形体的观察一致[9]，而本研究观察到4 ℃冰箱久置的青春双歧杆菌菌落出现了波状层次生长结构，而且产生了更大的自溶环，并交替出现，自溶环内的菌体生存形态多为球形体，其次出现了菌体断裂增殖，而正常的菌体形态较少。不透明圆环中主要是正常形态的菌体，可推测此处的增殖方式为正常的二分裂增殖。而常温下放置的青春双歧杆菌菌落没有出现自溶环。说明青春双歧杆菌菌体能通过生长、生存的菌体形态改变，以及增殖方式改变对环境变化做出响应，且该过程可能是细菌生命活动本身(代谢产物)引起的生长环境变化和培养过程中环境条件(培养基)动态改变的双重作用，进而诱导了青春双歧杆菌这种波状层次生长在低温久置条件下显现出来，这对青春双歧杆菌适应环境变化、维持种系稳定有何重要意义，为什么菌体在透明环处特殊的微生态环境条件容易自溶，以及自溶的意义，需要进一步深入研究。

[1] 徐启旺，刘俊康，袁泽涛，等. 生物波[J]. 科学,1999，11：47-49.

[2] 徐启旺，刘俊康. 生物波与人体抗癌能力诠释[M]. 香港：新青年出版社，2005：54-58.

[3] 刘俊康. 波动条件下绿脓杆菌相变的动态观察[D]. 重庆：第三军医大学，1995.

[4] 刘俊康.分子微生物学前沿[M]. 北京：科学技术出版社，2013：201-209.

[5] 邓国宏，丛延广，刘俊康，等.人膀胱癌细胞波状层次生长的研究[J]. 第三军医大学学报，2000， 22(5)：465-469.

[6] 刘俊康，袁泽涛，王源，等. 生物波特点的实验观察[J]. 中国微生态杂志，1999，11(2)：80-82

[7] 曾浩，邹全明，郭刚，等. 有氧胁迫幽门螺杆菌球形变异的实验研究[J]. 解放军医学杂志，2006，31(3)：199-202.

[8] 邓渝，吴小兰，刘俊康. 抗生素条件下奇异变形杆菌球形变异的初步实验研究[J]. 生物波科学与应用肿瘤学，2009，3：15-16.

[9] 刘俊康，闫国华，邓渝，等. 双歧杆菌属潜生体的初步实验研究[J]. 中华医院感染学杂志,2007,17(5):513-515.