弗赖森草螺菌RE3-3合成生长素及其促生作用的研究

程怀月， 石先阳

(安徽大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230039)

生长素(Auxin)是一类含有吲哚环结构的植物内源激素，可调节植物细胞的生长、根茎叶的分化及果实发育，在植物生长发育的各阶段发挥着重要作用[1-2]。吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)是植物体内主要的生长素形式，植物细胞IAA库的填充主要通过以L-色氨酸(L-tryptophan，L-trp)为前体的生物合成[3]。这种合成途径同样也在一些植物内生细菌体内发现[4-5]。具有分泌IAA活性的内生细菌可通过调节植物内源激素含量或提供外源激素，促进宿主植物的生长和发育[6-7]。草螺菌(Herbaspirillum)是一类广宿主内生固氮菌，已从甘蔗、玉米、高粱、水稻和多种牧草的根、茎、叶和种子器官内成功分离[8-9]。除了具有典型的固氮酶活性进行生物固氮，草螺菌还可通过产生IAA类物质而具有使宿主植物增产的潜能[10]。已有的草螺菌对植物促生作用研究主要集中于提高农作物产量[11-12]，而对湿地植物研究很少。随着城市化的日益剧增，芦苇(Phragmites)和香蒲(Typhaceae)等湿地植物的自然群落正在大面积减少[13-14]，因此对其量的增产研究是有必要的。本研究通过对菌株RE3-3产IAA的功能鉴定，深入解析营养物质和环境条件因素对菌株合成IAA的影响，优化其培养条件以便迅速且大量合成IAA。在最佳培养条件的基础上，研究该菌株合成IAA对水生植物芦苇及香蒲生长的影响，从而为合理利用该菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 弗赖森草螺菌(Herbaspirillumfrisingense)RE3-3菌株，由本课题组成员从芦苇根中分离筛选并鉴定。

1.1.2 培养基(g/L) 营养培养基(Nutrient Broth，NB)用于活化菌株RE3-3：牛肉膏 1.0，酵母粉 2.0，蛋白胨 5.0，NaCl 5.0，pH 7.2；基础培养基(Minimal Medium，MM)用于检测IAA的形成：NH4Cl 0.25，MgSO4·7H2O 0.226，KH2PO43.0，NaHPO4·12H2O 15.12，pH 7.0；植物生长所需的基本培养基为1/2 MS(Murashige and Skoog)，根据文献提供的MS培养基配方[15]，配制本实验所需的1/2 MS培养基(即所有试剂浓度相对于MS培养基减半)。

1.2 方法

1.2.1 菌株RE3-3产IAA的鉴定 将菌株RE3-3接种到NB培养液中，150 r/min、30 ℃培养24 h。取0.1 mL菌液(OD600为1.0)接种到含0.05% L-trp的MM培养液中，以1%葡萄糖为碳源，150 r/min、30 ℃培育48 h。将所得菌液12 000 r/min离心5 min，上清液保存备用。取1 mL上清液与Salkowski′s显色液[16](H2SO4∶ddH2O∶0.5 mol/L FeCl3·6H2O=150∶250∶7.5)以1∶2(体积比)的比例进行混匀，IAA标准液作为阳性对照，室温避光静置30 min后，观察其颜色变化，若有红色生成则表明有IAA的形成。

1.2.2 培养条件对菌株RE3-3合成IAA的影响 下述实验中若无特别说明，则pH为7.0，温度30 ℃，L-trp含量为0.05%，以葡萄糖为碳源，培养48 h。分别研究pH、温度、L-trp含量、碳源及培养时间对菌株RE3-3合成IAA的影响，通过优化培养条件从而得到IAA的合成最大量。pH：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；温度：15、20、25、30、35、40 ℃；L-trp含量：0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%(质量分数)；碳源：蔗糖、淀粉、果糖、甘露醇、葡萄糖，添加量为1%；培养时间：24、48、72、96、120、144、168 h。

1.2.3 IAA对芦苇及香蒲的促生作用 以1/2 MS培养基为负对照，培养基中加入IAA标准物质为正对照，观察菌株RE3-3合成IAA对芦苇及香蒲幼苗生根的诱导现象[17]。选取生长状态良好、植株茎高相似的4周龄芦苇与香蒲无菌幼苗作为实验样本，将这些幼苗进行无菌切根处理，处理后的幼苗移栽到无菌培养皿中生长，并在培养皿中分别加入IAA标准物质及菌株合成IAA，每种IAA的浓度设定分别为0.5、1.0、1.5 mg/L，每个浓度有5组平行，每板培养皿中均有6株植株。培养2周后观察芦苇及香蒲生长情况，并记录在不同浓度IAA条件下芦苇和香蒲再生根及茎叶长度。

1.2.4 分析方法 通过测定培养液在600 nm处的吸光度来表征菌体细胞的生长量。培养液在12 000 r/min下离心5 min后，用Salkowski′s比色法在λ=530 nm下定量测吸光值。将1 g/L IAA标液稀释为系列浓度，与测样品相同方法测定吸光值，绘制标准曲线，参考标准曲线确定IAA含量[16]。采用液相色谱分析进一步证实IAA的产生：将备用上清液的pH值用1 mol/L HCl调至2.5，用等量的乙酸乙酯将溶液中的生成物质置换出来，重复3次，将乙酸乙酯层置于空气中干燥。用甲醇溶解干燥残留物作为高效液相色谱(AGILENT1260)及质谱(SATUKN2200)分析的试样[18]。其中以C18柱为高效液相色谱(HPLC)的固定相，流动相为V(甲醇)∶V(水)=75∶25。根长、茎长测量参照文献方法[19]，以游标卡尺为测量工具。在促生实验结束后，从每个培养皿中选取30株长势较均匀的芦苇和香蒲幼苗，用游标卡尺测量根长和茎长。利用ORIGIN 8.0和SPSS 20.0软件对实验数据进行处理和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株RE3-3合成IAA的定性检测

2.1.1 标液对照检测 为了分析菌株RE3-3是否具有产IAA能力，实验以MM培养液为对照，不同浓度(10、50、100 mg/L)IAA标准溶液为参照，对其产IAA能力进行分析[16]。结果发现菌株RE3-3培养液的显色液呈红色(图1)，即初步判定菌株RE3-3能够合成IAA。

图1 菌株产IAA的定性检测Fig.1 Qualitative test of IAA production of bacterial isolates

2.1.2 色谱检测 通过色谱法分析发现草螺菌GSF30T及Mb11均可在L-trp存在的前提下合成IAA[20]。而在本研究中IAA标准物的HPLC图谱显示主峰保留时间为6.093 min(图2A)，菌株培养液代谢产物的主峰保留时间则为6.157 min(图2B)，2个主峰保留时间几乎相同，误差在可接受范围(±0.2 min)内，即草螺菌RE3-3在L-trp存在的条件下，其培养液中代谢产物同样为IAA。通过质谱分析发现最强离子峰的m/z值为174(图2C)，生成物质的分子量为175(M+H+)，通过查找NIST数据库可进一步验证该物质是IAA。

2.2 不同培养条件对菌株RE3-3合成IAA的影响

2.2.1 pH的影响 菌株RE3-3在酸性(pH值3.0～6.0)与碱性(pH值8.0～10.0)条件下，IAA合成量都很少；但在酸性条件下，其合成量随着pH的增大而增大，而在碱性条件下其变化趋势相反(图3A)；pH在(7.0±1.0)范围内，IAA合成量先增至最大值(60 mg/L)再迅速下降，这一系列结果表明菌株RE3-3 IAA的合成对pH的适应能力弱。为了菌株RE3-3更好地合成IAA，与成团泛菌(Pantoeaagglomerans)PVM合成IAA对pH的要求一致[17]，后续实验中pH值设定为7.0。

2.2.2 温度的影响 温度不仅直接影响IAA的合成，还通过影响菌体量的生成从而间接影响菌株合成IAA[21]。温度为15 ℃时，菌株RE3-3的生长缓慢，其IAA的合成量也很少(1.5 mg/L)；随着温度升高，菌株RE3-3合成的IAA量也随之快速增长；温度到达30 ℃时，IAA的合成量达到最大值(61 mg/L)；之后IAA合成量随着温度的继续升高而下降，但变化较为平缓(图3B)。说明温度30 ℃是菌株RE3-3在pH 7.0培养条件下合成最大量IAA的最佳温度。

2.2.3 L-trp含量的影响 L-trp作为IAA合成的前体物质，其浓度过高或过低都会导致IAA合成量的减少(图3C)。当L-trp浓度为0.07%，IAA合成量达最大为74 mg/L；当L-trp浓度超过0.07%时，其合成量会受到抑制，这是因为L-trp过量时会形成邻氨基苯甲酸而对IAA的合成产生抑制作用，从而导致IAA合成量降低[22]。大多数弗赖森草螺菌属的细菌合成IAA的L-trp最适浓度为0.05%[20]，而本研究菌株RE3-3对L-trp的最适浓度则为0.07%。

图2 IAA谱图分析Fig.2 The spectrogram analysis of IAAA：工业合成IAA的液相色谱图；B：菌株合成IAA的液相色谱图；C：菌株合成IAA的质谱分析图A：HPLC analysis of standard IAA；B：HPLC analysis of synthetic IAA；C：mass spectroscopy analysis of synthetic IAA

2.2.4 碳源的影响 在5种碳源中，菌株RE3-3利用葡萄糖为碳源时最有利于IAA的合成(图3D)。不同碳源下产生的IAA量大小依次为葡萄糖(74 mg/L)>甘露醇(64 mg/L)>果糖(18 mg/L)>淀粉(1.2 mg/L)。蔗糖作为碳源，菌株RE3-3几乎不生长。这是由于草螺菌属不含有分解蔗糖的相应糖苷酶，从而不能利用蔗糖[23]。与固氮菌属根瘤菌(Rhizobiaceae)合成IAA对碳源的要求一样[24]，菌株RE3-3为了合成最大量IAA，后续实验要以1%葡萄糖为最佳碳源。

2.2.5 时间的影响 图3E给出了随着培养时间的递增，菌株RE3-3 IAA合成量先增至最大值而后随着时间的变化保持不变。即所有培养条件最优化后，培养24 h该菌合成IAA的量为41 mg/L，最大IAA合成量在48 h处，其值为74 mg/L。在最佳培养条件下，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)合成IAA最大量为22.7 mg/L[25]，链霉菌(Streptomycessp.)3s、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)540 以及植物短小杆菌(Curtobacteriumplantarum)6-I合成IAA最大量分别为20、67、78 mg/L[26]，对比其他菌属IAA合成量，菌株RE3-3的IAA合成能力明显较强。

2.3 IAA促进芦苇及香蒲生长

在培养条件最优的基础上，菌株RE3-3合成IAA为水生植物芦苇及香蒲提供外源生长物质。不同于对照组的芦苇及香蒲苗在生长过程中的茎叶出现枯黄，再生根生长长势极为缓慢，根部逐渐腐烂(图4b、图5b)。实验组两种形式IAA作用的植株生长长势良好，茎叶面积大，叶色浓绿，根系发达(图4、图5)，其中又以菌株合成IAA促生效果最好。IAA浓度的过高或过低对植株根系生长都存在不同程度的影响[27]，1.0 mg/L菌株合成IAA对芦苇及香蒲的促生效果最好，但IAA浓度为1.5 mg/L时则对植株的生长有着抑制作用(表1、表2)。

图3 菌株RE3-3合成IAA的影响因素Fig.3 The influence factors of strain RE3-4 synthesize IAA

图4 IAA对芦苇苗生长的影响Fig.4 Affecting Phragmites seedling growth by IAA a为正常培养且切根的芦苇苗；c、d、e分别为0.5、1.0、1.5 mg/L IAA标准物；b为对照组；f、g、h分别为0.5、1.0、1.5 mg/L菌株合成IAAa：meant normal culture and root pruning reed seedlings;c，d，e was 0.5，1.0，1.5 mg/L of standard IAA, respectively;b：meant control group; f，g，h was 0.5，1.0，1.5 mg/L of synthetic IAA, respectively

图5 IAA对香蒲苗生长的影响Fig.5 Affecting Typhaceae seedling growth by IAAa为正常培养且切根的香蒲苗；c、d、e分别为0.5、1.0、1.5 mg/L IAA标准物；b为对照组；f、g、h分别为0.5、1.0、1.5 mg/L合成IAAa：meant normal culture and root pruning cattail seedlings；c,d,e was 0.5，1.0，1.5 mg/L of standard IAA, respectively；b：meant control group;f,g,h was 0.5，1.0，1.5 mg/L of synthetic IAA, respectively

不同植物器官组织对IAA的敏感程度不同，植株根、茎组织在IAA的作用下其伸长率也不同[28]。对比相同浓度IAA标准物的作用效果，芦苇及香蒲苗在1.0 mg/L菌株合成IAA的作用下根系伸长最明显，分别增长27.78%、34.59%(表1)，茎高也分别增长了66.46%、40.88%(表2)。

表1 IAA标准物及菌株合成IAA对芦苇及香蒲再生根的影响Table 1 Effect of Phragmites and Typhaceae root by standard IAA and biosynthetic IAA

注：数据表示为平均值±标准差，每次实验重复3次，小样本个数为30；不同的小写字母表示在不同IAA浓度水平中的(在同一种IAA中)显著性差异(P≤0.05)，*表示在IAA标准物质与菌株合成IAA两个水平中的(在同一浓度IAA中)显著性差异(P≤0.05)；下表同

通过显著性差异分析(表1、表2)可看出，与成团泛菌(P.agglomerans)合成IAA促进烟草叶片生根效果优于IAA标准物作用的结果相似[17]，菌株合成IAA作用的芦苇及香蒲再生根长度都显著高于IAA标准物作用的，尤其是香蒲再生根根系明显发达、壮硕。则菌株RE3-3合成IAA以其自身合成快速、经济划算、促生效果明显等优点，有望应用于湿地生态系统植被增产等领域。

表2 IAA标准物及菌株合成IAA对芦苇及香蒲茎长的影响Table 2 Effect of Phragmites and Typhaceae stem length by standard IAA and biosynthetic IAA

3 讨 论

近年来，植物内生菌产生IAA对农作物促生作用的报道不断增多，但多集中于固氮螺菌和假单胞菌属等种属，弗赖森草螺菌作为一类常见的植物内生细菌，其合成IAA作用于水生植物的研究还鲜有报道。本研究结果表明弗赖森草螺菌RE3-3在L-trp存在的条件下合成的代谢产物是IAA。菌株RE3-3合成IAA的能力与培养基营养成分以及某些环境因素有直接的关系。在最优培养条件(培养基中含0.07% L-trp及1%葡萄糖，pH 7.0，温度30 ℃，培养时间48 h)的基础上，可使该菌产生较多的IAA，为水生植物芦苇及香蒲提供外源生长物质，促进芦苇及香蒲的生长和发育。这也意味着可将菌株RE3-3合成IAA有效地应用于湿地生态系统植被增产等领域，使该菌种具有一定的应用性价值。

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