疏花水柏枝内生真菌QY-1的抗氧化活性分析

蒋 维， 秦王阁阁， 孔玉珊， 李 辉， 薛艳红， 刘士平

(三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌 443002)

植物内生菌(endophyte)是一类生活于健康植物组织或器官内部的微生物[1]，近年来研究表明，内生菌不仅分布广泛，有极高的多样性[2]，而且经过漫长的“协同进化”后，其发酵产物种类丰富，生物活性广泛，是开发新型天然产物的重要来源[2]，成为微生物学和天然产物化学一个备受关注的交叉热点[1-2]。疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)是一种特异分布在三峡消落带地区的濒危植物[3]，每年要承受4～6个月的淹水胁迫[3]。淹水会导致供氧量减少，随后发生的不完全氧化将影响植物体正常的生长发育[4]。在这特殊生境的胁迫下，疏花水柏枝经过常年的进化，形成了一套抗氧化胁迫机制来应对。如：从疏花水柏枝中分离出一种叫3,4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯的物质，具有极强的抗氧化能力[5]。其内生真菌资源丰富[6]，且具备极强的抗氧化能力[6]。在前期研究中，本实验室在疏花水柏枝的根部分离到1株内生烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，其发酵液粗提物的抗氧化活性达到同浓度维生素C的30%[7]，暗示内生菌通过强抗氧化能力在疏花水柏枝长期对抗水淹胁迫的生态适应过程中发挥着重要作用。针对在寄主经受氧化胁迫分离的内生菌是否具有高抗氧化活性这一化学生态学的问题，本研究从疏花水柏枝分离的一株经初筛具高抗氧化活性内生真菌出发，对其进行了分子鉴定，结合体外和体内的方法，对发酵液提取物及其主成分的抗氧化能力进行了综合评价，并提出了可能的作用机理，这些研究将为该菌株的进一步应用和天然抗氧化剂的筛选与研发提供了参考，同时对明确特殊生境下内生真菌与宿主的化学生态学关系有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株QY-1分离自淹水前疏花水柏枝的叶片中，适度厌氧条件下获得[6]，4 ℃石蜡保藏。后期的研究发现QY-1在正常有氧状态下也可生长，故在实验中采用正常的有氧培养。

1.1.2 培养基 PDA培养基、LB、DMEM/F-12 完全培养基等[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分子鉴定 将4 ℃保藏的QY-1接种于PDA固体培养基中，具体鉴定办法参照高媛等[7]的办法进行。将获得的序列采用Mega5.0软件进行多重对比，用N-J法建立系统发育树。

1.2.2 分离提取及胞外抗氧化能力测定 菌株的PDA发酵液直接用总抗氧化试剂盒(T-AOC，南京建成生物工程研究所)进行测定[6]。其粗提物分别采用DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法[9-10]和铁氰化钾(Potassium Ferricyanide，PF)还原力测定法[9-10]测定其抗氧化能力，各重复3次，以相同浓度的维生素C作为正对照。粗提方法：将QY-1于200 mL (500 mL锥形瓶) PDA培养基中培养10 d，然后将菌悬液通过真空抽滤装置过滤，得菌体与发酵液。菌体用70%丙酮常温浸提24 h，浸提3次，超声1.5 h，过滤菌丝，55 ℃下旋转蒸发浓缩、冷冻干燥得菌体相粗提物。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次得酯相和水相，分别在45 ℃和40 ℃下旋转蒸发浓缩、冷冻干燥合并得到发酵液粗提物。将QY-1 粗提物用甲醇溶解后，选用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=7∶3∶0.1进行薄层色谱，获得一主物质SF2，抗氧化能力分析同前。

1.2.3 胞内抗氧化作用分析 为进一步确定QY-1代谢物质在细胞内的活性，分别以原核生物代表(大肠埃希菌DH5α)、真核生物人神经母瘤细胞SH-SY5Y为测试对象，分别建立了200 μmol/L 和800 μmol/L的H2O2氧化损伤模型，测定其粗提物对过氧化氢的损伤保护作用。先将大肠埃希菌在LB培养基中37 ℃、100 r/min培养12 h，加入不同浓度的发酵液粗提物，培养12 h后，加入浓度为200 μmol/L 的H2O2溶液，继续培养12 h后，用分光光度计测定其在600 nm的吸光值，计算大肠埃希菌细胞的存活率，以1 mg/mL的维生素C做正对照。抑制率(%)=((正常生长下的吸光值-处理下的吸光值)/正常生长下的吸光值)×100%。神经细胞的氧化损伤保护作用参照Huang等[8]的方法进行，用MTT法测细胞存活率。乳酸脱氢酶(LDH)渗漏率检测时将QY-1粗提物的浓度控制在1 000 μg/mL，具体按照试剂盒(Biovision，美国)提供的方法进行；凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9及SOD(超氧化物歧化酶)的活性检测使用碧云天生物技术公司试剂盒，具体方法见产品使用说明。所有数据重复3次，通过spss19.0统计分析。

2 结果与分析

2.1 内生真菌菌株QY-1的鉴定

内生真菌QY-1分离自疏花水柏枝淹水前厌氧条件下的叶片中，菌落在PDA上生长缓慢，初期菌落为白色绒毛状，渐变成暗青色，里层颜色较深，呈黄褐色，菌丝呈放射状(图1A)，背面为米黄色，菌落难以挑起，液体发酵溶液较深，呈黄褐色，菌丝无色透明，有分支和隔膜(图1B)，近球形的子囊壳散生或群生(图1C)。

图1 QY-1的菌落形态、显微形态及分子鉴定Fig.1 Morphology of colony, hyphae & conidia and molecular characterization of QY-1A：菌落形态；B：显微形态；C：子囊壳；D：基于ITS序列构建的系统发育树A: Morphology of colony; B: Back of the dish; C: Micromorphology；D：Phylogenetic tree

将QY-1的总DNA提取后，以其为模板，使用通用上游引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，得到约600 bp的片段，回收后在上海瑞迪生物科技有限公司测序，其18S rDNA的ITS序列通过EditSeq软件拼接，将测序结果在GenBank数据库(登录号为KU954091)中进行BLAST比对和同源性分析，并采用Mega 5.0软件，用N-J法建立了系统发育树(图1D)。结果表明，菌株QY-1 18S rDNA的ITS序列与球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)的序列相似性为100%，对照《真菌鉴定手册》[11]，比较分析QY-1和球毛壳菌的形态特征，判断QY-1是1株球毛壳菌。

2.2 QY-1在细胞外的抗氧化能力

在初筛时菌株QY-1就显示出极强的胞外抗氧化能力，其发酵液的总抗氧化活力(T-AOC) 达到55.90 U/mL, 远高于分离自山东泰安的青檀叶片中球毛壳菌No.81(其总抗氧化能力为16.12 U/mL[12],表1)，而且在本实验室从疏花水柏枝分离的163株内生真菌中(平均总抗氧化活力6.22 U/mL)，QY-1的抗氧化能力是最高的(表1)。将QY-1的发酵产物抽提后，将菌体相和发酵液相的物质分别配成1 mg/mL溶液，利用T-AOC试剂盒测定其总抗氧化活性，结果发现不管是菌体还是发酵液都含有大量的抗氧化物质(表1)，虽然QY-1在菌体相的抗氧化活性要高一些，但是由于菌体干物质量少(0.1～0.2 mg/100 mL)，所以后期实验采用发酵液来评价QY-1的抗氧化活性。用三种方法分析比较了QY-1发酵液提取物的抗氧化能力，结果表明不论是自由基清除率、总抗氧化活力，还是铁氰化钾还原力，QY-1都表现得非常出色，说明QY-1的提取物有着比较全面的抗氧化能力，达到同等浓度维生素C的50%水平。

表1 QY-1在细胞外的抗氧化能力

注：a：从疏花水柏枝中分离的163个内生真菌高抗氧化活性的平均值；b：粗提物和Vc的浓度均为1 mg/mL；“-”表示未测定

2.3 QY-1在细胞内的抗氧化能力

为进一步评价QY-1粗提物的抗氧化活性，利用本实验室建立的大肠埃希菌和人神经母瘤细胞的过氧化氢损伤模型，检测其是否对原核细胞和真核细胞具有氧化损伤保护作用。表2分析了QY-1的发酵液粗提物对大肠埃希菌的氧化损伤保护作用。质量浓度为10 mg/mL的提取物可以促进大肠埃希菌的生长，说明QY-1的粗提物对细胞生长没有毒害，反而有促进增殖作用。在200 μmol/L 的H2O2存在下，大肠埃希菌的生长明显受到抑制，抑制率达到55.39%，但是这种抑制效应在加有QY-1提取物时能够完全避免(表2)，2 mg/mL的QY-1提取物的保护效果达到1 mg/mL维生素C的50%。在2 mg/mL浓度范围内，随着提取物浓度增高大肠埃希菌细胞的存活率不断提高，将H2O2的抑制效应逐渐缩小。

表2 QY-1粗提物对大肠埃希菌细胞氧化损伤的保护作用

需要指出的是，这种保护作用不能排除是由于QY-1粗提物促进原核细胞增殖所致(表2)，因为在不加H2O2时，效果也很明显。为了进一步明确QY-1粗提物对真核细胞是否具有氧化损伤保护作用，选用人神经母瘤细胞SH-SY5Y，测定了在800 μmol/L的H2O2存在下细胞的存活率(图2)。结果表明QY-1的粗提物对神经细胞的氧化损伤具有较好的保护效果，在1 000 μg/mL浓度时，细胞存活率提高了63.6%(图2A)，但是在2 000 μg/mL时，保护作用却大幅下降，这一方面说明QY-1的粗提物对真核细胞同样具有抗氧化作用，另一方面也反映了对大肠埃希菌细胞和神经细胞而言所需求的最佳浓度不一致。

为了明确QY-1的粗提物对神经细胞抗氧化保护的可能机理，测定了其在氧化损伤状态下乳酸脱氢酶(LDH)的酶活。LDH是评价细胞膜完整性的重要指标，氧化损伤将导致LDH从细胞内渗漏到细胞液中[13]。实验结果发现，800 μmol/L的H2O2处理将会严重破坏神经细胞膜的完整性，使得LDH渗漏到细胞液的漏出率达正常细胞的12倍(图2B)，但是在添加QY-1的粗提物后，这种渗漏作用得到有效缓解，与经H2O2刺激过的细胞相比，LDH渗透率降低了81.5%，说明QY-1可以降低因H2O2导致的细胞膜损伤，从而起到保护神经细胞的作用(图2B)。

图2 QY-1的粗提物对神经细胞SH-SY5Y的氧化损伤保护Fig.2 Protective effects of QY-1 crude extract to nerve cells SH-SY5Y undergoing oxidative damageA：QY-1的粗提物对H2O2存在下神经细胞生长的影响；B：QY-1的粗提物对神经细胞LDH渗漏率影响；a、b、c表示Dumcan法测定的显著性差异(P<0.05)，3次重复A: The growth influence of nerve cells to QY-1 crude extract under H2O2 stress; B: LDH leakage rate affected by QY-1 crude extract; a, b and c means significant difference by Duncan test with P<0.05, n=3

2.4 QY-1的主成分分离及对神经细胞的抗氧化保护作用

将所获得的QY-1 粗提物用甲醇溶解，薄层色谱后分离得到一主要物质，命名为SF2(图3A)，物质结构正在鉴定中。为了寻找到合适的药物浓度范围，先将上述单体配制成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，处理SH-SY5Y细胞24 h后，弃去旧培养基，添加800 μmol/L的H2O2溶液继续处理8 h，用MTT法测定细胞存活率。结果表明25～100 μg/mL的SF2伤害最小(表3)，选择该浓度进行抗氧化保护作用分析。在25 μg/mL时对神经细胞的氧化损伤具有较好的效果(表3)，将神经细胞在H2O2胁迫下的相对存活率提高了58.6%。

表3 SF2对神经细胞的毒性及抗氧化保护作用

注：*和**分别表示差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01, n=3)；“-”表示未测定

为进一步分析SF2对神经细胞氧化损伤的保护作用机理，实验分别测定了SH-SY5Y细胞在SF2 6.25 μg/mL处理下的LDH、SOD、Caspase 3、Caspase 9的酶活表达情况。当神经细胞受到H2O2氧化损伤后，LDH渗出率升高、SOD酶活降低、凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9活性增高(图3)。虽然SF2对降低细胞的LDH渗漏率、保护细胞膜完整性作用并不明显(图3B)，对SOD抗氧化酶的酶活增加也不显著(图3C)，但是SF2却可以极显著地抑制凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达(图3D、E)，说明SF2可能通过抑制凋亡蛋白的表达来实现对神经细胞的抗氧化保护作用。

图3 SF2的分离及对神经细胞抗氧化保护作用的可能机理Fig.3 Isolation of SF2 and the possible mechanism to nerve cells in antioxidant protectionA: SF2的分离；B：LDH渗出率；C：SOD酶活；D：Caspase 3酶活；E：Caspase 9酶活；**表示极显著差异P<0.01, n=3A: Isolation of SF2; B: LDH leakage rate; C: SOD enzyme activity; D: Caspase 3 enzyme activity; E: Caspase 9 enzyme activity; ** means very significant difference with P<0.01, n=3

3 讨 论

近年来，植物内生真菌成为一种新型天然药物的重要来源[1-2]。本研究从能耐受低氧胁迫的植物疏花水柏枝一株具高抗氧化活性的内生真菌QY-1为研究对象，对其进行了生物学鉴定和抗氧化能力分析。结果表明QY-1是一株球毛壳菌，而且不管在胞外还是胞内，都表现出很高的抗氧化水平。其粗提物可保护神经细胞膜的完整性，减低乳酸脱氢酶的渗漏率。从粗提物中分离到一种主成分SF2，可有效抑制H2O2胁迫下凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的活性，这一系列研究结果表明，球毛壳菌QY-1具备较强的抗氧化能力，是一种具有潜在开发价值的抗氧化剂资源。

随着社会生活的进步，人类对新型抗氧化剂的研发提出了更多要求，越来越多的抗氧化剂用在食品、药品、化妆品等领域[9-10]。但是当前还没有一种通行的标准方法来准确评价物质的抗氧化能力，不同的方法可能有其局限性，导致实验误差较大[9-10]。限制了抗氧化研究的进一步发展。本研究结合3种体外测定方法和2种体内测定方法来评价抗氧化活性，取得了较好的效果，也进一步证实了QY-1的高抗氧化能力。

我们发现，在神经细胞遭受H2O2氧化损伤后，凋亡蛋白Caspase 3活性的增强程度明显高于Caspase 9，暗示Caspase 3在神经细胞氧化损伤时发挥着更大的作用。QY-1生产的主物质SF2，既可抑制Caspase 3，又可抑制Caspase 9的活性，暗示SF2可能通过抑制Caspase 3的活性来达到抗氧化保护作用，而可能通过抑制Caspase 3和Caspase 9的活性来达到促进细胞增殖的效果。

在分类学上，球毛壳菌属于子囊菌亚门(Aseomyeotina)、球壳目(Sphaeriales)、黑孢壳科 (Melanosporaceae) 和毛壳菌属(Chaetomium)[14]，是一种应用极为广泛的生防菌[15]。研究表明，球毛壳菌可通过产生抗菌物质[16]、竞争性抑制植物病原菌的生长[17]、诱导植物产生系统抗性[18]等作用。本实验室也发现QY-1可以有效抑制柑橘橘青霉(Penicilliumcitrinum)的生长，从而达到柑橘生物保鲜的效果[19]。球毛壳菌是否通过产生高抗氧化物质来诱导物种发生氧化爆发从而起到光谱抗性，将是未来极有意义的一个研究方向。

本研究通过QY-1的提取分离，获得了一种主成分SF2，对神经细胞的氧化损伤起到一定的保护效果。但是值得说明的是，QY-1的粗提物与主成分SF2的作用机理是不一致的，如粗提物可以明显抑制LDH渗漏到胞质，可是SF2却丧失了此能力，说明在QY-1的粗提物中还存在一些其他的抗氧化物质。未来的实验一方面要进行SF2鉴定，另一方面需进一步明确QY-1起抗氧化作用的物质基础，根据活性跟踪的方法获得高抗氧化活性的化合物，为进一步研发新型抗氧化剂提供参考。

[1] García A, Rhoden S A, Rubin Filho C J, et al. Diversity of foliar endophytic fungi from the medicinal plantSapindussaponariaL. and their localization by scanning electron microscopy [J]. Biological Research, 2012, 45(2): 139-148.

[2] Venugopalan A, Srivastava S. Endophytes asinvitroproduction platforms of high value plant secondary metabolites [J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(6): 873-877.

[3] Tian W, Bi Y H, Zeng W, et al. Diversity of endophytic fungi ofMyricarialaxifloragrown under pre-and post-flooding conditions [J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(3): 10849-10862.

[4] 张阳, 李瑞莲, 张德胜, 等. 涝渍对植物影响研究进展[J]. 作物研究, 2011, 25(2): 420-424.

[5] 田伟, 毕玉婷, 周启龙, 等. 没食子酸酯对神经细胞的抗氧化保护作用研究[J]. 天然产物研究与开发, 2013, 25(10): 1423-1427.

[6] Zeng W, Qin W, Tian W, et al. Antioxidant activity in vitro of endophytic fungi fromMyricarialaxiflora, a riparian plant with strong tolerance ability of flooding [J]. Journal of Pure and Applied Microbiology, 2015, 9(1): 87-95.

[7] 高媛, 雷旗, 蒋维, 等. 一株高抗氧化活性内生真菌的分子鉴定及产酚酸类物质研究[J]. 微生物学通报, 2016, 43(6): 1235-1243.

[8] Huang S L, He H B, Zou K, et al. Protective effect of tomatine against hydrogen peroxide-induced neurotoxicity in neuroblastoma (SH-SY5Y) cells[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2014, 66(6): 844-854.

[9] Prior R L, Wu X L, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(10): 4290-4302.

[10] Valavanidis A, Nisiotou C, Papageorgiou Y, et al. Comparison of the radical scavenging potential of polar and lipidic fractions of olive oil and other vegetable oils under normal conditions and after thermal treatment[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52:2358-2365.

[11] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1979: 90-121.

[12] 高强. 青檀内生真菌球毛壳菌的抗氧化活性和发酵产物的研究[D]. 南京, 南京：师范大学, 2013.

[13] Speen A, Jones C, Patel R， et al. Mechanisms of CDDO-imidazolide-mediated cytoprotection against acrolein-induced neurocytotoxicity in SH-SY5Y cells and primary human astrocytes[J]. Toxicology Letters, 2015, 238(1): 32-42.

[14] 叶丽丹, 劳佳萍, 卢建平, 等. 球毛壳菌荧光标记与重寄生现象研究[J]. 浙江大学学报, 2007, 33(2): 119-124.

[15] Park J H, Choi G J, Jang KS, et al. Antifungal activity against plant pathogenic fungi of chaetoviridins isolated fromChaetomiumglobosum[J]. FEMS microbiology letters, 2005,252(2): 309-313.

[16] 迟玉杰, 杨谦. 毛壳菌对植物病害的生物防治及存在的问题[J]. 农业系统科学与综合研究, 2002, 18(3): 215-218.

[17] 印敬明, 刘晓光, 万慧, 等. 螺旋毛壳 (Chaetomiumspirale) ND35防病促生作用初探[J].莱阳农学院学报, 2007, 23 (4): 272-275.

[18] 高广增. 球毛壳ND35菌株的促生,抗病和抗旱作用及机制初探[D]. 泰安: 山东农业大学, 2012.

[19] 孔玉珊，秦田明，薛艳红，等. 疏花水柏枝内生真菌对三峡地区柑橘致腐菌的拮抗作用研究[J].食品工业科技，2015, 36 (8):175-177.