4株羊瘤胃功能性细菌的筛选

崔小蕾， 王红英， 李阳阳， 钱斯日古楞

(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034)

抗生素以饲料添加剂的形式在养殖业中有广泛的应用，使用抗生素能让牲畜在抗病、防病方面获得良好的效果，但也导致牲畜体内病原体耐药性的提高和抗生素在食品中残留的问题[1]。随着人们不断地发现抗生素带来的诸多负面作用，抗生素被越来越多的国家在动物饲料中禁止使用[2]。因此寻找可代替抗生素产品的研发和应用势在必行。“益生菌”一词被定义为活的微生物饲料添加剂，通过改善动物肠道内微生物系统的平衡，达到对动物产生有益效果的目的[3]，可作为抗生素替代物。其主要作用是促进动物对致病菌的抵抗能力，加强宿主肠道内壁黏膜的屏障作用，减少致病菌侵入动物组织内，改善其健康状态[4]。同时，益生菌还能维持肠道菌群平衡，预防幼畜疾病，减少有害气体的产生，净化环境，改善畜产品品质，生产出无公害产品，并节省饲料，降低成本，提高经济效益[5-6]。反刍动物瘤胃内分布着多种微生物，包括瘤胃原虫、细菌、真菌和古细菌等，这些微生物在动物肠道中相互制约，相互促进，进行复杂的生理活动，参与动物体内营养物质的降解和吸收过程，从而促进动物机体的生长[7]。动物胃肠道微生物菌群不仅促进营养物质的消化吸收，促进生长，同时菌体产生大量的抗体，能维持机体免疫系统处于激活状态[8]，使微生物与自身免疫系统相互作用，逐渐达到动物肠道与免疫系统的稳定[9]。目前国内外的研究，主要集中在羊瘤胃液提取物制备饲料添加剂及其应用等，而从羊瘤胃自然菌群中筛选出功能性菌，并对其产酶特性进行研究和未来开发利用微生态制剂的研究非常有限[10]。本研究从羊瘤胃菌群中筛选出具有产纤维素酶、蛋白酶或淀粉酶的细菌菌株，并对它们的形态特征和对指示菌的抑菌效能进行检测。希望该成果对反刍动物微生态制剂的开发提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 筛选菌种来自大连地区圈养的2岁绵羊的瘤胃内容物。大肠埃希菌ATCC25922 (EscherichiacoliATCC25922)、副溶血弧菌ATCC17802 (VibrioparahemolyticusATCC17802)、藤黄八叠球菌HY78 (SarcinaluteaHY78)和产气杆菌AS1489 (AerogenesAS1489 )等指示菌均由辽宁检验检疫局动物检验所提供。

1.1.2 培养基 富集培养基：葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 5.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，硫酸镁0.5 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 6.0；细菌分离纯化培养基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化钠 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.5～6.0，琼脂20.0 g；LB培养基：蛋白胨 10.0 g，酵母浸出汁 5.0 g，氯化钠 10.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌种的富集培养 取4 mL用4层纱布过滤的羊瘤胃液，混入富集培养基中，在37 ℃厌氧培养箱中厌氧培养2 d。

1.2.2 菌种的分离与纯化 将富集培养液用无菌水进行梯度稀释至10-1～10-10的不同菌悬液。从不同稀释液中分别吸取200 μL，涂布在分离纯化培养基上，37 ℃厌氧培养2 d。挑出单个菌落在另外分离纯化培养基上划线，37 ℃继续厌氧培养2 d，反复操作至出现单菌落。单菌落菌体用试管斜面在4 ℃保藏，备用。

1.2.3 筛选产酶特性的瘤胃功能性细菌 ①产生纤维素酶特性：采用刚果红脱色法，在纤维素选择性培养基上筛选出产纤维素酶的菌株[11]。利用DNS法测定纤维素酶酶活，以葡萄糖为标准物制备标准曲线(y=0.684 4x-0.004 3)[12-13]。纤维素酶酶活按公式(1)计算。

(1)

式中b和a为由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求得；x为样品OD值的平均值；n为酶粉(液)的稀释倍数；T为酶促反应时间(min)；0.5为所加酶液的量(0.5 mL)；180为葡萄糖相对分子质量。酶活定义为，在pH 4.6条件下，1 mL酶液水解底物1 min产生1 μmol还原糖所用的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。②产生淀粉酶特性：利用碘与淀粉变蓝的原理，在淀粉选择性培养基上用碘液煤染法挑选出产淀粉酶的菌株[14]。淀粉酶酶活的测定按1.2.3①中的纤维素酶酶活测定方法进行。③产生蛋白酶特性：在肉汤培养基中加入干酪素，培养菌株，最后挑选出具有透明圈的菌落菌株为产蛋白酶的菌株。利用福林酚法测得菌株产蛋白酶的酶活，酪氨酸为标准物制备标准曲线(y = 0.901 5x-0.019 5)[15-16]。蛋白酶的酶活按公式(2)计算。

(2)

式中A为标准曲线中OD值为1时所对应的酪氨酸的量；x为样品平行试管的平均吸光度；4为试管中反应液总体积(4 mL)；n为酶液稀释的倍数；10为反应时间10 min。酶活定义为，在40 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位(U/mL)。

1.2.4 抑菌特性筛选的瘤胃功能性细菌 ①菌体活化：将筛选到的菌株及4种指示菌分别接种于LB液体培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养24 h，进行活化。②抑菌特性的检测：将稀释好的4种指示菌均匀涂布在LB固体培养基上。将筛选的不同菌株分别发酵培养24 h后，离心取上清液200 μL至LB固体培养基上的牛津杯中， 30 ℃培养24 h，观察对指示菌的抑菌效果，挑选出具有抑菌作用的菌种[17-19]。

1.2.5 筛选菌种的形态特征 通过对菌株进行产酶特性和抑菌特性的研究，选出优异菌株C5、C9、C12、C13，并对其形态特征进行电子扫描显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 瘤胃功能性细菌的产酶特性

2.1.1 产纤维素酶特性 经菌体筛选从羊瘤胃菌群中分离得到16种菌株，分别编号为菌株C1～C16。采用刚果红脱色法发现，除了菌株C2、C9、C14外，其余菌株均产纤维素酶，酶活测定结果见图1。由图1可见，菌株C3、C4、C5、C8、C12、C13产纤维素酶的酶活高于其他菌株，其中菌株C13的纤维素酶酶活最高，达到3.59 U/mL。该结果与张丽萍等[20]在牛瘤胃中筛出的细菌菌株产纤维素酶的酶活(3.72 U/mL)活性较为接近。

图1 筛选菌株产纤维素酶的活性Fig.1 Enzyme activity of cellulase produced from strains screened

2.1.2 产淀粉酶特性 经淀粉选择性培养基鉴定得出，除菌株C1、C3、C4、C8、C14、C16外，其余菌株均产淀粉酶，结果见图2。由图2可见，菌株C2、C5、C6、C9、C12产淀粉酶的酶活较高，其中菌株C5的淀粉酶酶活最高，达23.37 U/mL，且菌株C2、C6、C9、 C12的酶活均高于10 U/mL以上。这个数据与徐颖等[21]在淀粉厂周边的土壤中筛出的细菌菌株产淀粉酶酶活(20.83 U/mL)活性比较，活性较高。

图2 筛选菌株产淀粉酶的酶活Fig.2 Enzyme activity of amylase produced from strains screened

2.1.3 产蛋白酶特性 经蛋白酶鉴定培养基的培养发现，除菌株C1、C3、C4、C10、C14、C16外，其余菌株产蛋白酶明显，酶活测定结果见图3。由图3可见，除菌株C2产蛋白酶的酶活较低外，其余菌株产蛋白酶的酶活均较高，其中菌株C5产酶酶活最高，达46.82 U/mL,与李婵娟等[22]在土壤中筛出的细菌菌株产蛋白酶酶活(11.5 U/mL)活性比较，活性很高，添加到饲料中，对羊瘤胃吸收蛋白质有很好的作用。

图3 筛选菌株产蛋白酶的酶活Fig.3 Enzyme activity of protease produced from strains screened

2.2 瘤胃功能性细菌的抑菌特性

通过牛津杯法观察筛选菌株对指示菌的抑菌效果，发现除菌株C2外，其余菌株对4种指示菌有不同程度的抑制作用。通过抑菌圈大小的比较，得出抑菌效果见表1。

表1 筛选菌株对指示菌的抑菌活性

注：“-”表示无抑菌活性

由表1可知，菌株C1、C3、C5、C6、C7、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16对副溶血弧菌指示菌有抑制活性，其中菌株C1、C3、C5、C7、C12、C13、C14、C15为低度敏感；菌株C6、C9、C10、C11、C16为中度敏感；菌株C3对产气杆菌有抑制活性，且为中度敏感。菌株C1、C3、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16对大肠埃希菌有抑制活性，其中菌株C8、C9、C11、C14、C16为低度敏感；菌株C1、C3、C5、C6、C7、C10、C15为中度敏感；菌株C12、C13为高度敏感。菌株C1、C5、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16对藤黄八叠球菌有抑制活性，其中菌株C5为高度敏感；菌株C1为中度敏感；其余菌株均为低度敏感。

2.3 瘤胃功能性细菌的形态特征

将产酶特性优越，抑菌活性良好的菌株C5、C9、C12、C13在扫描电子显微镜下观察，结果见图4。

图4 瘤胃功能性细菌的形态特性Fig.4 Morphological character of functional bacteria from sheep rumen

由图4可见，菌株C5为杆菌，菌体长度为3.15 μm，属长杆菌，表面无荚膜;菌株C9为芽胞杆菌，属端生芽胞，菌体长度为2.62 μm，表面有荚膜;菌株C12为芽胞杆菌，属端生芽胞，其菌体长度为2.13 μm，属短杆菌，表面无荚膜;菌株C13为杆菌，菌体长度为2.96 μm，属短杆菌，表面无荚膜。以上4种菌均属于兼性厌氧型细菌。

3 讨 论

反刍动物瘤胃中分布许多益生菌，它们能产生纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等多种酶，参与机体对食物的消化吸收，同时通过生理代谢，对体内有害细菌产生抑菌作用，促进机体的免疫功能。本研究从羊瘤胃菌群中分离、纯化得到16种菌株，测定其产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的特性和抑制大肠埃希菌、副溶血弧菌、产气杆菌和藤黄八叠球菌等指示菌的特性，并通过电子显微镜观察其形态特征。结果表明，菌株C13的纤维素酶酶活最高，达3.59 U/mL；菌株C4、C5、C8产纤维素酶酶活均在3 U/mL以上；菌株C3、C12产纤维素酶酶活接近3 U/mL。菌株C5的淀粉酶酶活最高，达23.37 U/mL；菌株C12的淀粉酶酶活在20 U/mL以上，仅次于菌株C5；菌株C2、C6、C9的淀粉酶酶活均在10 U/mL以上。菌株C5产蛋白酶酶活最高，为46.82 U/mL；而菌株C6、C7、C11、C12、C13、C15产蛋白酶酶活也均在40 U/mL以上。抑菌活性方面，菌株C6、C9、C10、C11、C16对副溶血弧菌的抑制效果明显，菌株C3对产气杆菌有抑制作用，菌株C1、C3、C5、C6、C7、C10、C12、C13、C15对大肠埃希菌有抑制作用，其中菌株C12、C13的抑制作用最明显。菌株C1、C5对藤黄八叠球菌均有很高的抑制作用。综上所述，菌株C5产淀粉酶和蛋白酶的能力较强，且对副溶血弧菌、大肠埃希菌和藤黄八叠球菌有很明显的抑制作用；菌株C9有产淀粉酶和蛋白酶的能力，且对副溶血弧菌和大肠埃希菌有明显的抑制作用；菌株C12能产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶，其对大肠埃希菌的抑制作用很强；菌株C13能产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶，其对大肠埃希菌的抑制作用明显。

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