西藏传统发酵奶制品中乳酸菌多样性分析及产胞外多糖菌株筛选

李理，陈丽娥，王剑飞，殷瑞杰，李宝磊，李言郡，陈苏

(1.杭州娃哈哈集团有限公司研究院生物工程研究所，杭州310018；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028)

0 引言

西藏地处青藏高原，是我国五大牧区之一。西藏地区的环境较为干燥、日照充足、昼夜温差大，拥有丰富的奶资源，发酵奶制品种类繁多，主要有酸乳、酥油、奶渣、奶酒等[1]。西藏地区的发酵奶制品通常采用古老的传统方法制作而成，并蕴含了相当丰富的乳酸菌菌种资源，当地居民也长期保持着食用发酵奶制品的习惯。这些菌株经过长时间的驯化，产生了优良且独特的发酵性能，可使发酵奶制品形成良好的组织状态和独特的风味口感。

乳酸菌产生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是发酵奶制品形成黏稠、拉丝等特殊质构的重要物质之一，亦可提供丝滑的口感，起到为发酵奶制品增稠、稳定、乳化、凝胶及持水等作用[2]。因此，筛选能够高产胞外多糖的菌株一直是研究者们关注的重点方向。

高海拔地区传统发酵奶制品中的菌种是我国独有珍贵的乳酸菌菌种资源，对这些菌种进行分离、保藏、多样性分析及发酵性能的研究，对开发具有我国自主知识产权的生产用乳酸菌菌种具有重要的意义[3]。本研究采集了西藏高海拔地区的22份传统发酵奶制品，并对其中的乳酸菌进行分离、纯化、多样性分析及发酵性能研究，旨在筛选到具有良好产黏性状的菌株，为开发新型特色乳酸菌发酵剂提供菌种资源支持。

1 实验

1.1 样品来源

试验所用的样品采集自西藏当雄、格达乡等6个地区的22份传统自制发酵奶制品，其中包括奶渣（干/湿）5份、发酵酸牛乳（耗牛/奶牛）7份、酥油5份、奶酒2份、西藏灵菇2份。

1.2 培养基与试剂

M RS肉汤培养基，用于乳杆菌的增殖培养，英国OXO ID公司；M RS固体培养基，液体培养基中添加1.8%琼脂，用于乳杆菌的分离培养；M 17肉汤培养基，用于乳球菌的增殖培养，美国BD公司；M 17固体培养基，液体培养基中添加1.8%琼脂，用于乳球菌的分离培养；脱脂乳培养基，10%脱脂乳，105℃灭菌10 min，用于原始样品的活化。

细菌基因组DNA提取试剂盒，上海生工生物工程有限公司；PCR扩增试剂，宝生物工程（大连）有限公司；脱脂乳粉，新西兰恒天然集团；硫酸、苯酚、氯化钠均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器与设备

SG 403A-HE-INT型超净工作台，5417R型高速离心机，TW 20型电热恒温水浴锅，BX 50型光学显微镜，XR+型凝胶成像仪，Mastercycler PROS型PCR仪，HV-110全自动高压蒸汽灭菌锅，KB400型生化培养箱，SevenMulti型pH计，Mettler-Toledo；16-03342-01型乳品发酵监控仪。

2 方法

2.1 样品采集[4]

液体样品用一次性无菌吸管转移至预先装有灭菌甘油的15 mL无菌离心管中，震荡混匀后封口，标记编号；固体和半固体样品用烧过的药匙挖取适量样品（约10 g），直接装于带有灭菌甘油的50m L无菌离心管，确保样品完全浸没在甘油中，封口标记编号。上述采集样品各采集两份，装于内含冰袋的保温箱中，短时间内运回实验室后-20℃保存，样品尽快进行微生物分离纯化等试验。

2.2 乳酸菌的分离、纯化和保藏

分离前，取适量原始样品置于灭菌的脱脂乳培养基，37℃活化12 h。取经活化的样品用无菌生理盐水梯度稀释，其中稀释度为10-4，10-5，10-6进行M RS和M 17平板涂布；每个处理两次重复。平皿置于厌氧袋中，37℃恒温培养，至有单菌落形成。观察菌落形态，并详细记录各菌落的颜色、大小、凸起程度和光泽度。挑取具有乳酸菌典型特征的单菌落接种于对应的MRS或M 17液体培养基中，37℃培养16～24 h。

取适量生长好的菌悬液涂片、固定、革兰氏染色，观察菌体细胞形态和排列方式。将形态和排列不一致的菌落培养物进行划线纯化，直至镜检菌体细胞的形态和排列方式一致。

将纯化好的菌株接种于MRS和M 17液体培养基，37℃培养2～3代。离心洗涤菌体，再次革兰氏染色、镜检。纯的菌体培养物添加适量甘油，分装于1.8 mL无菌旋盖冻存管中，标号后入-80℃低温冰箱保存。

2.3 乳酸菌分离株的鉴定

2.3.1 基因组DNA的提取

取1 mL各菌株的培养物置于1.5 mL无菌离心管中，室温，转速8 000 r/min离心1 min，弃上清，收集菌体，加入180μL溶菌酶溶液重悬菌体，37℃金属浴60 min，再加入20μL蛋白酶K溶液，震荡混匀，56℃金属浴30 min至菌体细胞完全裂解。后续操作按试

PCR扩增采用50μL反应体系：2×PCR M aster-M ix 25.0μL，正向引物（浓度10μmol/L）1.0μL，反向引物（浓度10μmol/L）1.0μL，模板DNA 2.0μL，补加ddH2O至50μL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃（1 min），57℃（1 min），72℃（1 min），30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

PCR产物的检测：PCR产物在含有EB质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测。100 V电泳35 min，UV下观察条带，产物于4℃保存。

2.3.3 扩增产物测序分析与比对

将PCR扩增产物与16s通用引物送至上海生工生物有限公司进行双向测序。双向测通的序列结果（未测通需进行拼接）与NCBI-BLAST数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中已鉴定菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，鉴定分离菌株的种属。

2.4 产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选[5]

2.4.1 菌落拉丝法初筛

将2.3.3中鉴定为乳酸菌的菌株活化后，选择适当的稀释梯度分别涂布于MRS和M 17平板，恒温37℃培养24～48 h。用一次性无菌接种针挑取平板上黏稠且能形成明显拉丝的单菌落，并记录2 s内垂直离开培养基表面形成连续拉丝的最大长度，每个菌落平行3次处理。

2.4.2 菌株复筛

将初筛中能形成明显拉丝的菌落接种于50 mL MRS或M 17液体培养基中，37℃恒温培养16～24 h。50 mL菌体培养物，加入1 mL体积分数为80%的三氯乙酸，4℃静置过夜，转速8 000 r/min离心20 min，弃上清，装入透析袋中置于去离子水中4℃透析24 h，每隔8 h换一次水。透析液中加入3倍体积的95%乙醇，4℃静止过夜，多糖呈絮状沉淀，转速8 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀进行冷冻干燥处理。得到的白色絮状粉末进行胞外多糖含量的测定，并结合拉丝情况复筛产胞外多糖的菌株。

2.5 胞外多糖含量的测定

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[6]，配置不同浓度的标准葡萄糖溶液，测定波长490 nm处的吸光值。葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线为y=0.0116x-0.0074，R2=0.9994。

准确称取各菌株胞外多糖10 mg，纯水定容至50 mL，采用苯酚-硫酸法测定其吸光值，根据标准曲线回归方程计算胞外多糖的含量。

2.6 产胞外多糖菌株发酵的性能

剂盒标准抽提步骤进行，提取得到的DNA立即进行PCR扩增或-20℃保存。

2.3.2 16S rDNA片段扩增与检测

扩增引物采用乳酸菌16S rDNA片段通用引物，上 游 引 物 27F：5’-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3’，

下游引物1492R：5’-AAGGAGGTGCTCCAG CC-3’。

2.6.1 菌株产酸性能测试

复筛得到的菌株活化两代后，生理盐水调整菌液OD至0.8。2%比例接种至100m L质量分数为10%灭菌脱脂乳中，42℃静止发酵12 h，发酵过程检测乳样品pH值变化，记录并绘制变化曲线。

2.6.2 发酵乳流变性能测试[7]

发酵乳测试样品4℃冷藏过夜后破乳，静置30 min。取适量样品进行旋转扫描测定各发酵乳的动态黏度变化曲线，比较不同菌株发酵所得发酵乳样品的质构特性。以市售直投式酸奶发酵剂为对照，对照发酵剂制备的酸奶质构粘稠，拉丝感强。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌的分离结果

经革兰氏染色和过氧化氢酶实验，22份采集样品中共分离出113株乳酸菌，在MRS和M 17平板上多数形成乳白色或半透明、边缘整齐或有锯齿状、中间凸起、表面湿润有光泽或粗糙的菌落。显微镜下，杆菌两端呈现圆形短棒状、线性排列，部分长杆呈现弯曲形态。球菌多数为椭球性或圆形，以成对、成链排列方式居多，部分乳酸菌镜检结果如图1所示。

图1 分离菌株革兰氏染色镜检图片

113株乳酸菌中，分离得到杆菌82株，占总分离菌株数量的72.57%，分离球菌数量31株，占27.43%。比较分析各样品分离得到的杆菌、球菌数量可知（表1），除发酵酸牛乳样品外，奶酒、奶渣、西藏灵菇等样品中分离到的杆菌数量明显多于球菌数量，说明22份西藏传统发酵乳制品中的乳酸杆菌为优势群体。

表1 西藏地区发酵乳制品分离乳酸菌数量统计

3.2 西藏地区传统发酵乳制品中乳酸菌多样性分析

经16S rDNA序列比对后，31株球菌中，鉴定出4个菌属，分别为5株明串珠菌属、18株链球菌属、3株乳球菌属、5株肠球菌属。明串珠菌属全部来源于奶渣和牦牛酥油样品，分别为2株肠系膜明串珠菌、1株乳酸明串珠菌和1株假肠膜明串珠菌。链球菌属中只有嗜热链球菌（18株），其中14株来源于发酵酸牛乳样品，另外4株来源于奶渣和酥油，说明嗜热链球菌主要存在于发酵酸牛乳中，其余形式的发酵样品中存在较少。乳球菌属只有乳酸乳球菌乳酸亚种，来源于酥油、奶酒和奶渣样品。肠球菌属有2株坚韧肠球菌，全部来自于酥油，另有3株屎肠球菌，分别来自于西藏灵菇和酥油。82株乳杆菌属鉴定出12个菌种，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种（23株）、发酵乳杆菌（18株）、瑞士乳杆菌（11株）、植物乳杆菌（9株）、短乳杆菌（7株）。占比最大的德氏乳杆菌保加利亚亚种主要来自于发酵酸牛乳和西藏灵菇，发酵乳杆菌主要来自于酥油，瑞士乳杆菌、植物乳杆菌主要来自于酥油和奶渣，短乳杆菌主要来自于奶酒。另外，酥油样品中还分离得到1株卷曲乳杆菌和1株凝结芽孢杆菌。

分析上述结果，发现113株分离株中，德氏乳杆菌保加利亚亚种占总数量的10.18%，是本研究采集西藏地区传统发酵奶制品中的优势菌株，这个结果与扎木苏[4]

对西藏地区传统牦牛奶制品中乳酸菌的多样性分析结果是一致的。除德氏乳杆菌保加利亚亚种外，嗜热链球菌和发酵乳杆菌也是本次采集样品中的优势菌种，其他研究发现西藏地区的传统发酵制品中的优势菌株还有戊糖片球菌[8]和乳明串珠菌[4]。

3.3 产胞外多糖菌株的筛选结果

产胞外多糖菌株的筛选旨在筛选到能够为发酵乳提供质地黏稠、有拉丝感的发酵剂菌种，因此初筛通过平板菌落拉丝法筛选到能够产生黏性胞外多糖，其中菌落呈黏液状或能够形成明显拉丝的菌株有16株，具体情况如表2所示。

表2 产胞外多糖初筛及复筛情况

由表2中可知，呈黏液状（无拉丝）和能够形成拉丝的菌落的菌株均能够产生的胞外多糖。胞外多糖的含量基本与形成拉丝的长短一致，且产生胞外多糖较多的菌株均是能够形成明显的拉丝的菌株，说明我们筛选得到菌株产生的胞外多糖均为黏性胞外多糖[9]。综合初筛拉丝长度和胞外多糖产量，初步确定德氏乳杆菌保加利亚亚种1576（LB1576）、嗜热链球菌1605（ST 1605）和发酵乳杆菌1600（LF1600）为3株高产黏性胞外多糖的乳酸菌，并对其发酵性能进一步研究。

3.4 高产胞外多糖菌株产酸性能

将LB1576、ST 1605、LF1600活化两代后，接种至灭菌脱脂乳中，42℃静止发酵12 h，检测并记录各样品发酵过程中pH值的变化情况，结果如图2所示。

图2 高产胞外多糖菌株产酸性能

结果显示，发酵过程中，3个样品的pH值先逐渐降低后趋于平稳，说明3株乳酸菌能够利用脱脂乳中的营养成分产生乳酸，形成凝乳结构。LF1600的产酸能力较强，发酵6 h后，pH值达到4.11，且后酸化比较稳定,ST 1605的延滞期较短，在发酵前期的产酸速率较高，LB1576的产酸速率比较适中。

3.5 发酵乳流变学性能测试结果

为了确定筛选到的高产胞外多糖的菌株是否能赋予发酵乳较良好的组织状态和质构特性，对3种发酵乳样品的流变学性能进行测试。通过旋转扫描，能够测定不同剪切应变率下的黏度，这一指标可以间接反映发酵乳在入口、留口和吞咽过程中的黏度变化趋势，结果如图3所示。

图3 高产胞外多糖菌株发酵乳旋转扫描测试结果

由图3中结果可知，与对照商品直投式发酵剂相比，3株高产胞外多糖的菌株发酵所得的发酵乳能够形成较高的黏度。当剪切应变速率在0.001～0.01 s-1时，发酵乳的状态类似于处于货架期和入口的状态，此时的黏度较高，说明发酵乳能够在货架期内表现出良好的稳定性，同时在入口时表现出更好的稠厚感。有研究表明，发酵乳呈现出较高的黏度与其发酵菌株产生胞外多糖密切相关[10]。本实验的结果显示，菌株LB1576产胞外多糖的含量最多，其发酵乳的黏度也最高，说明这株产黏性胞外多糖的乳酸菌LB1576作为发酵剂，能够提高发酵乳的黏度，从而提高其在货架期和消费过程中的感官品质。

4 结论

从22份西藏地区传统发酵奶制品中共分离得到113株乳酸菌，经16S rDNA比对鉴定可归类为6个属19个种。乳杆菌属较为丰富，包含12个种，德氏乳杆菌保加利亚亚种23株、发酵乳杆菌18株、瑞士乳杆菌11株、植物乳杆菌9株、短乳杆菌7株、副干酪乳杆菌5株、开菲尔乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌各2株、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌各1株，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种是本研究采集样品的优势菌种。

113株乳酸菌中筛选到16株可在乳基中产生胞外多糖的菌株，其中有3株产量较高，分别为德式乳杆菌保加利亚亚种1576、嗜热链球菌1605和发酵乳杆菌1600。通过发酵性能测试，发现菌株1576的产酸适中、后酸化稳定、发酵乳黏稠度高，能够在一定程度上提高产品的感官品质。

[1]王雪艳.西藏高海拔地区酸奶中乳酸菌分离鉴定及其产酸能力评价[D].西藏：西藏大学，2016.

[2]胡盼盼，宋微，单毓娟，等.影响乳酸菌胞外多糖产量的因素[J].食品科技，2014，39（9）：31-38.

[8]蒋厚阳，陈芝兰，赵国华，等.PCR-DGGE法分析西藏传统发酵乳制品中乳酸菌的多样性[J].食品科学，2014，35（1）：167-174.

[3]陈芝兰，杨吉霞，李梦寒，等.西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析[J].食品科学，2013，34（17）：140-146.

[4]扎木苏.西藏地区传统好牛奶制品中乳酸菌的多样性研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.

[5]邵丽.胞外多糖乳杆菌的筛选及其多糖的分离、结构和生物活性研究[D].无锡：江南大学，2015.

[6]张睢杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：11-12.

[7]侯保朝，葛红娟，赵建云，等.乳酸菌发酵剂制备发酵乳的特性研究[J].中国乳品工业，2014，42（11）：17-21.

[8]蒋厚阳，陈芝兰，赵国华，等.PCR-DGGE法分析西藏传统发酵乳制品中乳酸菌的多样性[J].食品科学，2014，35（1）：167-173.

[9]LEIVERS S,HIDALGO-CANTABRANA C,ROBINSON G,et al.Structure of the high molecular weight exopolysaccharide produced by Bifidobacterium animalis subsp.lactis IPLA-R1 and sequence analysis of its putative EPS cluster[J].Carbohyd Res,2011,346(17):2710-2717.

[10]于静，曾小群，王鸿飞，等.高产胞外多糖乳酸菌的筛选及其发酵条件优化[J].中国食品学报，2015，15（2）：93-98.