牛奶、婴儿配方奶粉中硒元素的形态研究进展

刘梦霞，于景华

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

0 引言

硒在自然界中通常以有机形式和无机形式存在[1]。各种硒化合物的不同的生理、生物活性，及其迁移转化规律，不仅取决于硒的总质量分数水平，而且同硒存在的化学形态以及不同化学形态下硒化物的浓度水平直接相关[2]。有研究表明硒的有机形式吸收率可达85%～95%，而无机形式吸收率仅为40%～50%左右[3]。动物体中的硒主要与蛋白质结合，硒在人体内发挥生理作用主要是通过硒蛋白来实现的[4]。硒是目前公认的人体必需微量元素之一[5]。它是人体多种蛋白质的重要组分，还有提高人体免疫力，抗氧化、对抗自由基，预防癌症等多种功效[6]。

研究牛奶和婴儿配方奶粉中的硒元素对婴儿健康有重要意义。本文对现有的牛奶、婴儿配方奶粉中硒元素形态的研究进行总结、比较，旨为婴儿配方奶粉中硒元素形态研究提供指导。

1 牛奶蛋白中的硒

在牛奶中，大于95%的硒与蛋白质相连。对脱脂乳进行超速离心，分离得到酪蛋白和乳清蛋白，通过离子交换色谱和凝胶色谱分别分离酪蛋白和乳清蛋白中的蛋白质，氢化物原子吸收光谱法测定分离所得各种蛋白质中硒元素的质量分数，得到牛奶蛋白中的硒元素分布情况如表1所示[7]。从表中可以看出大于70%硒存在于酪蛋白中。单位质量κ-酪蛋白含硒量最多，但由于奶中κ-酪蛋白质量分数低，所以该蛋白中的硒质量分数仅占脱脂乳硒质量分数的17%，而β-酪蛋白中硒的质量分数占脱脂乳硒质量分数的33%，比例最大，αs-酪蛋白、β-乳球蛋白中硒质量分数分别占脱脂乳硒质量分数17%，6%～8%，其他蛋白中硒质量分数占脱脂乳硒质量分数的3.5%。Bierla[9]等人在研究硒元素在牛奶蛋白中的存在形式时，也表明大部分硒元素存在于酪蛋白中；而硒元素与乳清蛋白结合，可能是通过硒代甲硫氨酸残基取代β-乳球蛋白、α-乳白蛋白中的甲硫氨酸残基，形成新的含硒蛋白质。T IEN HOAC[8]也证实硒元素在牛奶乳清蛋白中主要与β-乳球蛋白、α-乳白蛋白结合。

表1 牛奶中硒元素的分布情况[7]

2 奶中硒元素形态的测定

硒元素在牛奶和婴儿配方奶粉中通常以硒化合物（如硒-蛋白质、硒-多肽）的形式存在，这类乳制品中复杂的成分会对硒化合物的提取造成干扰，降低硒化合物的提取效果，进而影响其测定准确性。因而许多学者针对提取及测定硒化合物的方法进行改进优化，提高硒元素在乳制品中的测定准确性。例如学者林立[10]改进的酸处理法能够提高硒元素的形态稳定性。下面对这些方法的优缺点进行论述。

2.1 样品处理方法

2.1.1 酸法处理

林立[10]等人在测定奶粉中硒形态时，对样品进行乙酸沉淀蛋白、流动相（三氟乙酸、柠檬酸、乙醇）提取，通过加标回收试验验证，发现采用该方法提取时，硒元素的各形态之间未发生相互转化。而且在后续ICP-M S方法测定过程中能够减小基质效应的影响，增强检测的灵敏度、准确性和稳定性。但在测定得出结果后发现该提取方法对奶粉中硒代胱氨酸的提取效率低，一方面由于硒代胱氨酸易与奶粉中的蛋白质吸附共沉淀，另外硒代胱氨酸中的Se-Se化学键不稳定，容易断裂与蛋白结合，因此采用合适的离子对试剂并采用温和的提取方式，可以有效地络合硒代胱氨酸，避免破坏硒代胱氨酸的稳定性，从而提高硒代胱氨酸的提取率。

2.1.2 酶解法

通过酶解的方法可以使牛奶、婴儿配方奶粉中的含硒蛋白质、多肽分解，从而得到含硒氨基酸，再对其进行质量分数测定。而且酶解的条件温和，大多数为37℃，pH 7.0，不易引起乳制品中硒元素形态之间发生转变。通常使用蛋白酶和脂肪酶处理，提取过程中需要控制酶解温度、时间及光照情况，以防止有机硒转化为无机硒，影响测定结果[11-13]。但此方法时间略长，通常在10 h以上，在后续提取过程中可改进方法如超声辅助酶解等以提高效率。

2.1.3 有机溶剂提取法

有学者用蛋白沉淀法即乙腈提取牛奶中的游离硒蛋氨酸，可以直接提取出纯的硒蛋氨酸，避免了分离硒化合物的繁琐步骤，同时减少了对硒蛋氨酸形态的影响，在后面使用UPLC-M S/M S方法测定硒蛋氨酸质量分数时可以得到较好的精确度、精密度[14]。但该方法仅对游离硒蛋氨酸提取效率高，有其他硒元素形态相互转化的风险。

2.1.4 微波消解法

微波消解法能同时加热所有的样品溶液而不加热容器，微波加热时，溶液能很快达到沸点，同时微波能引起酸与样品之间较大的热对流，搅动并清除已消解的不活泼样品的表层，促进酸与样品更有效地接触。在加压的条件下，酸的氧化及活性增加，使粒径大的样品也能在短时间内被消化。其次，微波消解是在密闭的容器中进行的，待测元素的损失较少，回收率较高，因微波消化过程中酸的消耗少，减少了由于酸而带入的污染，从而提高了测定结果的准确性。常用的酸为硝酸[15-16]。

2.2 硒化物分离及形态测定方法

2.2.1 离子色谱－电感耦合等离子体质谱法

有国内学者采用离子色谱－电感耦合等离子体质谱法（IC-ICP-MS）检测婴儿配方奶粉中硒的形态，通过优化提取方法和色谱条件，能够实现硒酸盐、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的定性定量分析，方法的检出限在0.03～0.10μg/L之间。加标回收率在25.0%～105%之间，测定值的相对标准偏差（n=6）在1.8%～7.8%之间。测定6种奶粉检测出硒酸盐、亚硒酸盐，均未发现硒代蛋氨酸[10]。分析可能是奶粉中硒代蛋氨酸质量浓度低于该检出限，可以尝试将蛋白溶液进行低温浓缩，使硒代蛋氨酸质量浓度升高，然后重新进行检测。若仍未发现硒代蛋氨酸，则可推断该婴儿配方奶粉中可能不存在硒代蛋氨酸。ICP-MS具有很高的灵敏度、准确度，并且它与色谱的接口容易实现，色谱分离柱与ICP-MS的雾化器直接相连即可。由于上述的众多优势，电感耦合等离子体-质谱已经成为元素形态分析的重要工具。

2.2.2 液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法

原子荧光光谱灵敏度高，选择性好，适用于氢化物发生元素的测定。在线性范围以及光谱干扰等方面均比原子吸收光谱优越。同时，原子荧光光谱仪器设备购买和运行的费用低，一般的实验室就可以配备。

O scar[11]等人通过液相色谱-紫外-氢化物发生-原子荧光光谱法联用技术分析喂养不同硒化物饲料的奶牛产出的牛奶中硒的形态。使用反向色谱C 18柱，流动相选用氯化四乙胺，优化预还原条件即使用紫外照射和电热板来提高不同硒化物转化效率。最后测得硒代胱氨酸、Se（IV），硒代蛋氨酸、Se（VI）检出限分别为0.4，0.5，0.9，1.0μg/L。在喂养含硒酵母饲料的奶牛产出的牛奶检测出亚硒酸盐、硒代胱氨酸和少量硒代蛋氨酸；在喂养无机硒饲料的奶牛产出的牛奶中仅检测到硒代胱氨酸和亚硒酸盐。表明奶牛摄入硒的形态对牛奶中硒元素的形态有影响。该方法可用于测定牛奶中硒的形态，快速方便且重复性高，检出限低，可用于常规牛乳质量检测。

Pilar Vinas[12]等运用液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法的联用技术分析婴幼儿配方奶粉中硒的形态：亚硒酸盐、硒酸盐、硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，检出限分别为0.4，1.7，0.35，0.54μg/L。该方法使反相C 18色谱柱和离子交换柱串联连接，流动相为水、磷酸盐缓冲液。用标准物质即已知硒元素含量和种类的全脂奶粉样品验证该方法可靠性，证实该方法可以用于奶粉中硒元素形态的测定。用本方法检测6种婴儿配方奶粉，结果显示仅含亚硒酸盐。

2.2.3 超高效液相色谱-串联质谱法

UPLC-MS/MS法具有特异性好、灵敏度高、分析速度快和准确可靠的优点，适用于牛奶中游离硒代蛋氨酸（SeMet）的定量测定。何梦洁[14]等人建立超高效液相色谱-串联质谱法测定硒SeMet的方法，使用C 18色谱柱，以水∶乙腈∶甲酸（95∶5∶0.1，体积比）为流动相。结果SeMet线性范围为0.5～100 ng/mL，SeMet批内准确度在97.6%～100.6%，批间准确度在97.7%～99.2%，批内精密度在0.53%～4.49%，批间精密度在1.03%～4.54%。用于测定牛奶中游离SeMet，牛奶中游离SeMet质量浓度为0.74 ng/mL。

2.2.4 石墨炉原子吸收法

Tuzen等[16]用超声辅助离子液相分散液液微萃取-石墨炉原子吸收法测定饮料中硒酸盐、亚硒酸盐的含量，并测定出牛奶、水果、酒类等食物中硒元素的总量。黄高明[15]采用超声波破碎，离心、透析的方法将有机硒与无机硒分开，微波消解法进行样品消化，利用石墨炉原子吸收法对富硒酸奶中有机硒的质量浓度进行测定。该方法检出限为2.5μg/L，精密度为3.24%～8.27%（RSD），加标回收率为98.5%～101.3%，这些方法都可以借鉴到婴儿配方奶粉的硒元素的测定中。

3 不同分子量乳清蛋白中的分布情况

Bermejo[17]采用SEC-HPLC-HG-ETAAS联用技术测定了硒元素在牛奶乳清中的分布情况。为克服硒元素在牛奶乳清各蛋白中浓度低的问题，优化富集硒元素的条件，首先离心分离牛奶不同成分即脂肪、乳清、酪蛋白，收集乳清部分并进行超滤浓缩，浓缩物进入SEC色谱分离，UV检测蛋白质。超滤浓缩蛋白部分，消化并收集硒氢化物，在铱涂层石墨管中预富集硒氢化物。ETAAS Zeeman背景校正法测定硒元素的含量。实验中测定了6种牛乳基婴儿配方奶粉，结果表明硒元素主要存在于分子量为40 ku，大于160 ku，小于10 ku部分，其中分子量小于10 ku部分硒含量最高。与Rafael等人[18]的研究结果一致：试验的绝大多数婴儿配方奶粉样品中，硒元素分布在低分子质量蛋白部分。与前文测定牛奶中硒元素分布情况对比，可以发现牛奶与婴儿配方奶粉中硒元素分布不同。说明在婴儿配方奶粉原料调配及生产过程中硒元素形态含量都发生了变化，而研究这些具体的变化对婴儿营养健康状况意义重大。

4 加工过程对硒元素的影响

目前国内外对婴儿配方奶粉生产过程中硒元素形态变化研究较少。L.H.Foster等人[19]在1998年研究了巴氏杀菌和喷雾干燥对液态奶、强化硒酸钠、亚硒酸钠液态奶中硒含量的影响。通过分别配制标准液态奶、强化硒酸钠、亚硒酸钠液态奶，进行巴氏杀菌、喷雾干燥工艺的对照处理，用氢化物原子吸收分光光度计法测定硒含量得出结论：巴氏杀菌使液态奶、强化硒酸钠液态奶、强化亚硒酸钠液态奶中硒含量含量分别减少了7.9%，6.2%，7.0%。喷雾干燥使液态奶、强化硒酸钠液态奶、强化亚硒酸钠液态奶中硒含量分别减少了44.8%，11.4%，10.0%。巴氏杀菌、喷雾干燥之后液态奶、强化硒酸钠液态奶、强化亚硒酸钠液态奶中硒含量含量分别减少了49.2%，17.6%，15.6%。分析硒含量减少的原因可能为加热过程中热空气和粉末颗粒之间的温差导致液态奶中固有的硒减少；存在于乳清中的谷胱甘肽过氧化物酶中加热过程中被破坏导致硒元素在喷雾干燥过程中挥发。

莫海珍在2007年研究甘蓝及毛豆储存及加工过程中硒元素形态的变化。试验中甘蓝的含硒组分以甲基硒半胱氨酸为主，其次为硒蛋氨酸，另外含有痕量的硒胱氨酸，在毛豆中硒主要以硒蛋氨酸的形式存在，而硒甲基硒半胱氨酸的含量很少。冷藏会导致硒的含量随着时间的延长而减低，采用真空烘干、热风烘干和喷雾干燥对于甘蓝和毛豆进行脱水，其中冷冻干燥对于有机硒的保存率最高，硒蛋氨酸是热不稳定成分，在喷雾干燥过程中损失最大。说明加热、喷雾干燥等加工过程会对硒元素的形态变化产生影响。

总结上述研究结果，学者林立[10]、Pilar Vinas[12]仅在奶粉中发现硒元素的无机形态，而研究牛奶中硒元素形态时，O scar[11]、何梦洁[14]等都检测出了硒元素的无机形态和有机形态。可以推及硒元素形态在婴儿配方奶粉的加工过程中发生了变化，但具体发生了哪些变化和变化的机理还有待研究。

5 展望

对于不能被母乳喂养的婴儿来说，婴儿配方奶粉是婴儿的主要营养来源，营养元素的形态关乎其吸收状况和婴儿的成长。目前来看，由于现行的主流方法都依赖于特定形态的标准硒化物，而现有的标准品只有仅限的几种，并不能满足全面分析乳制品中硒元素形态的要求，所以导致对牛奶、婴儿配方奶粉中硒元素形态认知不全面，能确定的形态仅有硒酸盐、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸；而且在奶粉加工过程中的硒元素的含量、形态变化研究甚少。另外，由于硒元素在牛奶、奶粉中含量非常少，而且多与蛋白相连，硒化合物提取过程中极易被破坏，所以需要不断探索出灵敏度高、精确度高的测定方法，预测多维分离手段结合及多项分析技术联合将成为未来发展趋势。

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