新疆发酵乳中保加利亚乳杆菌的耐药性研究

任彩霞，郭慧玲，李丽娜，张文羿，孙天松

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室奶制品加工农业部重点实验室，呼和浩特 010018)

0 引言

乳酸菌是人们认可的安全菌株，作为菌株发酵剂使用已有较长的历史[1]。其定殖于人类及动物的胃肠道中，对人体具有重要的益生作用[2-5]。保加利亚乳杆菌是发酵酸乳的主要乳酸菌之一，最早由保加利亚人Stam en Grigorov发现[6]，具有多种生理功能[7]。目前，人们使用抗生素来治疗细菌感染，部分细菌对其产生了耐药性。研究者们最初只发现某些食源性致病菌具有抗生素耐药性[8]，之后，在葡萄球菌和乳酸菌中也检测到了抗生素耐药基因[9]。近年来的研究表明，我们食品中使用的乳酸菌有的具有抗生素耐药性，有的甚至携带抗生素耐药基因[10-12]，部分耐药基因还可能进行水平转移[13-15]。保加利亚乳杆菌也不例外。AKPINAR[16]和SOZZ[17]报道，保加利亚乳杆菌对抗生素具有耐药性，有的甚至具有多重耐药性。

因此，为了判断分离自新疆地区酸牛乳中保加利亚乳杆菌的安全性，本实验采用肉汤稀释法测定5株受试菌株在15种抗生素条件下的耐药表型，并通过PCR手段对已报道的耐药基因进行检测。最终的实验结果可能会对同行的乳酸菌抗生素耐药性研究提供一定的参考。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 所用菌株与培养基

菌株：试验菌株保加利亚乳杆菌IMAU 32265，IMAU 32166，IMAU 32276，IMAU 32071，IMAU 32330均分离自新疆的酸牛乳，由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种保藏库(LABCC)提供。

培养基：M RS broth（OXO ID，CM 0359），M RSagar（OXO ID,CM 0361），LSM 培 养 基[18]:90%IST（ISO-SENSITEST broth；OXO ID，CM 0473），10%MRSbroth。

1.1.2 所用抗生素及试剂

抗生素：四环素（tetracycline，TET），新霉素（neomycin，NEO），红霉素（erythromycin，ERY），卡那霉素（kanamycin，KAN），环丙沙星（ciprofloxacin，CIP），链霉素（streptomycin，STR），利福平（rifampicin，R IF），克林霉素（clindamycin，CLI），氨苄西林（ampicillin，AM P），奎奴普丁/达福普汀（quinupristin/dalfopristin，QU I/DAL），甲氧苄啶（trimethoprim，TRI），利奈唑胺（linezolid，LINE），庆大霉素（gentamicin，GEN），氯霉素（chloramphenicol，CHL），万古霉素（vancomycin，VAN）。

试剂：生理盐水，TE缓冲液，5×TBE电泳缓冲液贮液，0.5mol/L EDTA，10%SDS，3m ol/L NaAc，5 m ol/L N aC l，1%的琼脂糖凝胶，酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，体积比），氯仿-异戊醇（24∶1，体积比），异丙醇，蛋白酶 K，dN TPs，10×PCR Buffer，Taq Polymerase，RNaseA，核酸染料等试剂，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.1.3 仪器

式中：Qk为单独空气源热泵机组的额定制热量，kW；K为富裕系数，取1.05；Ks为根据空气源热泵性能曲线在冬季空气调节室外计算温度(青岛市为-7.2 ℃[14])，热泵机组出水温度45 ℃下的制热量修正值，取0.79；Qg为单独燃气锅炉的额定制热量，kW.

冷冻离心机（5810R型），台式高速离心机（TGL-16B型），微量紫外分光光度计（ND-1000型），全自动高压蒸汽灭菌器（HA-300M），恒温水浴锅（HW S28型），电热恒温培养箱（DHP-9272型），UPV凝胶成像仪（GDS-8000型），电泳仪（DYY-12）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的制备及质控菌株的选取

取冻存管中的保加利亚乳杆菌，按1%接菌量活化于MRS液体培养基中,37℃恒温，培养24 h。之后将其划线培养至M RS固体培养基上，37℃恒温，培养48 h。挑取划线培养后的单菌落于5 mL生理盐水中，混匀，制成种子液，测定625 nm处菌株的OD值，直至OD值在0.16～0.2之间[19]（活菌数约为3×108mL-1）。

参照ISO 10932/IDF223，试验选取Lactobacillus paracaseiATCC 334做质控菌，质控菌株可用于检测试验的精确度及准确度[20]。在试验中，质控菌株的培养条件需严格控制。

1.2.2 抗生素溶液的制备

因为抗生素的溶解性不同，故抗生素溶液的制备分为水溶性和水不溶性两种。抗生素的配制溶剂及浓度范围参照文献[20-21]。根据不同抗生素的浓度测定范围，水溶性抗生素（LSM为溶剂）高浓度贮藏液需稀释为2倍于对应浓度梯度的抗生素溶液。，而水不溶性抗生素根据对应溶剂溶解后，抗生素高浓度贮藏液需稀释为10倍于对应浓度梯度的抗生素溶液,这与其溶剂的选择有关。稀释好的抗生素溶液置于-20℃保藏备用。

1.2.3 菌株耐药性的表型分析

本试验采用肉汤稀释法测定保加利亚乳杆菌的M IC值，具体方法参考文献[20]。

1.2.4 菌株全基因组DNA的提取DNA采[23]。用液氮冻融-CTAB法提取乳酸菌基因组

1.2.5 菌株耐药基因的检测

将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，根据已报道的抗生素耐药基因设计引物，采用50μL反应体系进行扩增。组成为：10×easytaq Buffer 5μL、dN TPs 4μL、基因组DNA模板1.5μL、上下游引物各1.5μL，Taq Polymerase 0.5μL、灭菌去离子水加至50μL。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性5 min；接着进行30个循环：94℃变性1 min，退火1 min，72℃延伸2 min；最终72℃末端延伸10 min。所扩增耐药基因的特异性引物序列及PCR退火温度见表1。PCR扩增结束后通过1%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测，并用凝胶成像仪分析结果。

2 结果与分析

2.1 菌株耐药性的表型分析

本研究采用欧洲食品安全局[24]、欧盟委员会[25]共同制定的保加利亚乳杆菌临界点的判定标准，分别将受试菌株的M IC值与临界点进行比较，MIC值高于临界点为耐药（R），低于或等于临界点则为敏感（S）。

试验结果如表2所示，5株受试菌对庆大霉素、四环素、新霉素、红霉素、卡那霉素、链霉素、利福平、克林霉素、氨苄西林、奎奴普汀/达福普汀、甲氧苄啶、利奈唑胺、氯霉素、万古霉素敏感，其MIC值表现为一定的差异，而且范围较广，从小于0.032～16μg/mL不等。5株受试菌对氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素）的M IC值范围为小于0.5μg/mL～16μg/mL；对万古霉素的MIC值为小于其测定的最低浓度，即小于0.25μg/mL，表现出极强的敏感性；对红霉素和利福平的MIC值分别为小于0.016μg/mL和小于0.125μg/mL。氯霉素对5株受试菌的抑制作用较低，MIC值为2μg/mL和1μg/mL，这一数据与KLARE[18]报道的结果相近。5株受试菌对氨苄西林的M IC值最高仅为0.064μg/mL，对甲氧苄啶的M IC值最高可达16μg/mL，这可能与氨苄西林和甲氧苄啶的结构不同有关。奎奴普汀/达福普汀和利奈唑胺对5株受试菌株的抑制程度接近，均在0.125～0.5μg/mL之间。对于四环素，除IMAU 32330的M IC值为小于0.125μg/mL外，其他菌株的M IC值均为0.5μg/mL。5株受试菌对环丙沙星的耐药性存在明显不同，IMAU 32071和IMAU 32276对环丙沙星敏感，而IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166对环丙沙星耐药，且M IC值范围较小，在2～16μg/mL之间。

2.2 菌株耐药性的基因型分析

通过特异性引物PCR扩增技术对受试菌株的常见抗生素耐药基因进行分析，统计结果如表3所示。5株受试菌均检出了红霉素耐药基因erm（B），IMAU 32265还检出了红霉素耐药基因erm（C），但表现为红霉素敏感性。IMAU 32265、IMAU 32166、

IMAU 32276和IMAU 32071检出了万古霉素耐药基因vanX，对万古霉素表现为敏感；IMAU 32166、IMAU 32276和IMAU 32071检出了利福平耐药基因rpoB，却表现为利福平敏感性；IMAU 32276还检出了氯霉素耐药基因cat，表现为氯霉素敏感性。受试菌株中，IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166虽表现为环丙沙星耐药性，但并未检出环丙沙星耐药基因gyrA、parC。其它耐药基因，如氯霉素耐药基因catA、红霉素耐药基因erm(B)-1、万古霉素耐药基因vanE在菌株中均未检出。除表4中所列基因在对应菌株中检出外，与四环素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素相关的耐药基因均未检出。

表1 特异性引物序列及PCR退火温度[21]

表2 5株保加利亚乳杆菌对15种抗生素的M IC分布结果

表3 保加利亚乳杆菌及耐药性基因

3 讨论

我国新疆地区地域辽阔，环境独特，这里的少数民族牧民生产的发酵乳制品大多以牛乳、羊乳、马乳和骆驼乳为原料，富含大量的有益乳酸菌[7]，保加利亚乳杆菌就是其中的代表。

本文研究的5株保加利亚乳杆菌均分离于新疆的酸牛乳，实验测定受试菌株的M IC时采用了肉汤稀释法，该方法是体外定量测定抗生素对细菌抑制活力的方法。测定过程中，不同浓度抗生素的液体培养基中加入定量的细菌，培养一定时间后，通过肉眼观察判定MIC值。与浓度梯度法[26]（Etest）、纸片扩散稀释法[27]（disk diffusion）、药物敏感实验[28]（Kirby-Bauer method）、微稀释法[29]（microdilution）等相比，肉汤稀释法操作方便，价格低廉，是实验室普遍使用的判断M IC的方法。之前的研究中，测定M IC所用的培养基为M RS培养基，但其结果的准确性备受质疑。HUYS[30]在用MRS与ISA（Iso-sensitest agar）培养基测定菌株的抗生素耐药性时发现，两种培养基条件下，同一菌株对庆大霉素的耐药性有显著差别，可能与M RS培养基中某些成分易与抗生素发生拮抗作用相关。随着研究的深入，KLARE[18]发现LSM培养基能结合MRS和ISA两种培养基的优势，并且能够降低拮抗作用的发生概率，对于抗生素耐药性检测较准确，故一直应用于乳酸菌抗生素耐药性研究中。

由于抗生素对细菌细胞的功能不同，目前已发现的抗生素可分为15类[11]。5株受试菌株对不同类的抗生素表现出不同的敏感性。对于能抑制核酸合成的利福平及环丙沙星，5株受试菌株的M IC值具有极大的差异。利福平对5株受试菌株具有敏感性，且抑制程度均相同，为小于0.125μg/mL。而5株受试菌株中，3株对环丙沙星耐药，M IC值范围在2～16μg/mL之间。Li等[31]所报道的环丙沙星耐药率（68.3%）与本试验结果接近。氯霉素、克林霉素、氨基糖苷类及四环素类抗生素虽均可抑制蛋白质的合成，但其敏感性存在区别。氯霉素与克林霉素相比，氯霉素对受试菌株的的耐药性较高；氨基糖苷类抗生素对受试菌株的抑制作用相对较低，卡那霉素、链霉素及新霉素的耐药性明显高于庆大霉素，这可能与庆大霉素的结构有关，进而能较好的通过细菌细胞膜。对于抑制细菌细胞壁合成的抗生素，如氨苄西林和万古霉素，5株受试菌株均表现出较强的敏感性。其中，氨苄西林的M IC值最高仅为0.064μg/mL，与周宁[32]得出的结果相似。NAW A[33]和郭慧玲[34]的报道中，保加利亚乳杆菌对万古霉素100.0%耐药，而试验中5株受试菌株对万古霉素均表现为敏感。显然，这与之前报道的有关万古霉素对乳酸菌作用机制的推断[35]是不吻合的。

在耐药基因检测方面，通过比对耐药基因PCR扩增产物，发现5株受试菌株检出了耐药基因erm(B)，IMAU 32265还检出了红霉素耐药基因erm(C)，却不具有红霉素耐药性。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166具有环丙沙星耐药性，却未检出耐药基因gyrA等。在部分受试菌中也检出了基因erm(C)、vanX等，但均无相关耐药性。有文献报道，分离自酸奶的乳酸杆菌表现为链霉素耐药性，却未检出与链霉素相关的耐药基因strA、strB、aadA等[1]；L.delbrueckii subsp.bulgaricus BFE 7430对氯霉素敏感，却成功检出了耐药基因cat[36]。这均与本试验结果较为相似。因此，菌株具有抗生素耐药性，不一定能检出与其耐药性相关的耐药基因；同样的，菌株携带抗生素耐药基因，不一定对该抗生素表现为耐药。影响菌株耐药性及耐药基因检出的因素有很多，归纳如下，（1）存在其他机制决定抗生素的耐药性，例如编码核糖体蛋白质或rRNA的基因发生突变[18]；（2）耐药基因在RNA水平未发生表达[36]；（3）调节基因表达的核苷酸序列发生了基因突变[37]；（4）菌株对抗生素的耐药性为固有耐药性，其耐药性由其它耐药基因引起；（5）菌株的耐药性来自于其它基因的水平转移。到底是何种原因导致本试验菌株出现以上情况，还需要我们进一步探究。

耐药基因的水平转移是影响食品安全的一大问题，致病菌和乳酸菌可通过基因的水平转移获得耐药性[38-39]，任何携带耐药基因的菌株都具有潜在的危害。因此，在对乳酸菌进行安全性评价时，除需检测菌株在抗生素条件下的M IC值及耐药基因外，还需进行耐药基因转移的判断，确保其安全后方应用于发酵生产中。

4 结论

分离自新疆的5株保加利亚乳杆菌对15种常见不同抗生素的耐药表型及基因型存在很大差异，且试验菌株的耐药表型与基因型间并非一一对应。IMAU 32330、IMAU 32265和IMAU 32166对环丙沙星耐药，对其他抗生素敏感；IMAU 32071、IMAU 32276对所有抗生素均敏感。5株受试菌株都检出了耐药基因erm(B)，部分菌株还检测到了vanX等，但5株菌均未检出环丙沙星相关耐药基因。因此，未来的研究中，菌株耐药表型与基因型不匹配的作用机制有待进一步研究。

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