CA15-3在犬乳腺肿瘤中的表达及其临床意义

刁洪秀 ， 张 润 ， 林德贵 ， 张 迪

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京海淀100193 ； 2.中国农业大学动物医院 ， 北京海淀100193)

犬乳腺肿瘤(Canine mammary tumor, CMT)是未绝育母犬最常见的肿瘤之一，其中约有41%～53%的病例恶性程度较高，严重危及宠物的生命健康[1]。在兽医临床中，乳腺肿瘤的诊断包括临床症状检查、X射线检查、组织病理学检查等，但对早期乳腺癌诊断价值有限。乳腺癌病因尚不确定，且早期症状不明显，因此，早诊断、早治疗是预防乳腺癌的有效手段。糖链抗原15-3(CA15-3)是一种高糖基化跨膜蛋白，在多数肿瘤组织中高表达，其胞外结构域在某些因素的刺激下会脱落进入血液循环，现已成为人医临床乳腺癌诊断和监测的生物标志物之一[2]，但在兽医临床上尚未见报道。因此，本研究以CA15-3为研究对象，检测其在健康犬和乳腺肿瘤患犬的组织和血清中是否存在差异，分析其在犬乳腺肿瘤中的作用和临床意义，为小动物乳腺肿瘤的诊断和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样本 所有样本均来自于2014年到2015年期间来本校动物医院就诊的病例。共收集乳腺肿瘤病例40例(10.26±2.5岁)，参照WHO发布的CMT国际组织学分级和Goldschmidt等[3，4]在2011年提出的CMT分类和分级标准进行组织学分类，即实体癌7例、混合癌6例、单纯乳腺小管癌5例、单纯乳头小管状癌3例、简单腺癌1例、癌肉瘤1例、恶性肌上皮瘤1例、腺鳞癌1例、混合腺瘤8例、良性混合瘤3例、腺瘤2例以及增生2例。健康犬33例(7.65±3.9岁)，所有犬均为雌性。

1.2 主要试验试剂和仪器 CA15-3 ELISA试剂盒，购自Biocheck公司；CA15-3单克隆抗体，购自Novus公司；SP-9002生物素-链霉卵白素免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。酶标仪、切片机、组织包埋机、烤片机、光学显微镜等。

1.3 试验方法

1.3.1 血清中CA15-3的检测 犬后肢隐静脉采血2 mL，促凝管中静置10 min，2 500 r/min离心10 min，取上清于1.5 mL EP管中，参照CA15-3 ELISA试剂盒说明书操作。

1.3.2 组织中CA15-3的检测 石蜡切片经过脱水、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色等过程进行免疫组织化学(IHC)检测。

免疫组织化学染色结果判读标准：CA15-3蛋白阳性信号主要集中在腺泡上皮和导管上皮顶膜和胞浆中，出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色。对每个IHC样本随机选5个视野进行拍照，采用Image Pro Plus对照片平均光密度值进行分析。

1.3.3 统计学分析 应用SPSS18.0对数据进行独立样本t检验和单因素方差分析，数据以平均数±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 试验结果

2.1 犬血清中 CA15-3含量的检测结果 犬血清样本中CA15-3浓度及其与临床病理因素的关系见表1。由表1可知，健康犬和乳腺肿瘤患犬血清中CA15-3浓度分别为5.72 U/mL±4.82 U/mL、15.70 U/mL±12.93 U/mL，两者之间差异显著(P<0.05)。乳腺肿瘤患犬中，血清中CA15-3浓度在不同年龄、不同病理类型和不同组织分级中无统计学差异(P>0.05)。经病例回访发现，预后良好和死亡的病例中，CA15-3浓度依次为12.49 U/mL± 8.04 U/mL, 22.84 U/mL±11.12 U/mL，两者之间存在统计学差异(P<0.05)。

表1 乳腺肿瘤患犬血清CA15-3水平与临床病理因素的关系

注：同一病理因素，数据肩头字母不同表示差异显著，P<0.05

2.2 犬乳腺组织中CA15 -3蛋白的表达 乳腺组织中CA15-3 部分IHC结果及其与临床病理因素的关系，见中插彩版图1和表2。正常乳腺组织中，CA15-3在乳腺上皮细胞中呈低表达。在乳腺肿瘤组织中，几乎所有样本均呈现中度到强阳性表达，胞浆和胞核着色较深，染色区域呈弥散状或颗粒状。使用Image Pro Plus软件计算所有样品的平均光密度(MOD)发现，CA15-3 MOD在乳腺肿瘤组织中要明显高于健康犬乳腺组织(P=0.008)，I 级、II 级、III 级肿瘤组织中，CA15-3 MOD值均存在统计学差异(P<0.05)，在不同年龄和不同病理分型中，CA15-3 MOD值不存在统计学差异(P>0.05)。经病例回访发现，不同预后结果之间，组织 CA15 -3蛋白表达没有显著差异(P>0.05)。

3 讨论

在人医临床上，肿瘤生物标志物的检测已成为继影像学诊断和组织病理学诊断之后, 临床最常用的肿瘤诊断方法之一。CA15-3是乳腺的相关抗原，存在于多种腺癌细胞内，是诊断乳腺癌较特异的标志物[5]。美国临床肿瘤学会于2007年将CA15-3推荐为乳腺癌预防、诊断及随访的重要肿瘤标志物之一[6]，但在兽医临床上鲜有报道。本试验中，40例乳腺肿瘤患犬血清中CA15-3浓度要明显高于健康犬，尽管乳腺肿瘤患犬血清CA15-3 浓度在不同病理类型和组织分级中不存在统计学差异，但在恶性肿瘤中其平均浓度上升了59.38%，且随着组织分级的加剧，其含量不断升高，说明CA15-3 同样适用于犬乳腺肿瘤的诊断。在预后回访中发现，死亡病例血清中CA15-3浓度要远高于预后良好的动物，说明血清CA15-3与犬乳腺肿瘤的预后有关。另外，在乳腺组织CA15-3 IHC结果中发现，CA15-3在乳腺肿瘤中的阳性检出率几乎是100%，且胞浆、胞膜和胞核呈中度到强阳性表达。以往的研究发现[7-8]，肿瘤组织中CA15-3主要呈胞浆内过表达，但也有文献说[9]，在细胞微环境发生变化时，CA15-3的胞内部分可能会脱落至细胞核，具体的作用机制还需进一步探讨。乳腺肿瘤组织中CA15-3 MOD值与病理分级密切相关，随着组织学分级的加剧明显上调，这与血清中CA15-3的结果相一致，说明组织中CA15-3的表达与犬乳腺肿瘤组织学分级具有明显的相关性。

表2 组织中CA15-3与犬乳腺肿瘤临床病理因素的关系

注：同一病理因素，数据肩头字母不同表示差异显著，P<0.05

4 结论

血清CA15-3可以作为犬乳腺肿瘤早期诊断和预后评估的生物标志物之一，组织中CA15-3的表达与肿瘤组织学分级密切相关，可作为评估犬乳腺肿瘤恶性程度的生物标志物之一。