痰液检验对肺曲霉菌病的诊断价值探讨

苏永华 李赛玉 陈丽静 李彩香 钟素成

近几年来，临床肺曲霉菌病发病率逐年攀升，死亡率高，但实验室检查诊断准确性较低，疾病诊断准确性也更低[1]。肺曲霉菌病判定金标准为组织病理判定，但危重疾病者取得病变组织难度较大，虽给予影像学诊断，可得到部分典型性影像特征，但会延迟诊断时间，缺乏特异性。实验室高灵敏度曲霉菌PCR检查，测定血液内曲霉菌细胞壁成分半乳甘露聚糖的GM实验均在临床得到快速应用，但仍然无法代替培养病原维生物的痰液标本标准化检验，识别痰液检查有形成分，培养污染得到控制，为及时、准确的判定肺曲霉菌病提供一定实验依据，降低疾病死亡率[2]。本研究纳入280例痰液标本，意在分析痰液检验诊断肺曲霉菌病的临床价值。具体报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料

随机抽取280例实验室痰液培养标本，包含男性152例，女性128例，年龄（63.2±1.2）岁，120例存在肺炎、COPD、支气管扩张、肺结核等肺部基础性疾病，124例器官恶性肿瘤，36例其他疾病。分布在我院ICU住院病例、肿瘤科、小儿科、神经外科、消化血液内科、呼吸内科等。

1.2 方法

1.2.1 检验痰液的方法 检验痰液包含孢子检查、真菌菌丝检查、细胞成分检查、真菌培养等。

1.2.2 留取痰液标本 采集标本的方法包含吸痰器抽、纤维支气管镜辅助抽吸、自主咳痰。按照其病情状况和意识状况给予合理性留取方法。护理人员需仔细向患者讲解留取标本注意事项，咳痰前需用生理盐水漱口3次，再咳嗽，并辅助性叩击其背部，将肺部深处痰液咳嗽出，所咳出的第一口痰液需丢弃，第2～5口痰液留取10 g，吐入到无菌培养皿直径9 cm中，1 h内送检。若延迟送检，需将其放入到6℃左右环境中保存，2 h内送检。持续送检3 d。针对痰液黏稠，且不易咳出者，可用蒸馏水进行雾化后，再将其吸出，并给予辅助方式将痰液标本抽取。

1.2.3 痰液培养 把所接收的标本进行沙氏培养基、中国蓝培养基、羊血培养基。接种量为0.5～1 g。3 mm直径接种环取5次，不同痰液黏稠度进行加减。并放置在37℃培养箱中培养24～72 h。并实施药敏试验与真菌菌种鉴定。

1.2.4 痰液显微镜检查 取5 g痰液，将其均匀涂抹在无菌载玻片上，涂抹范围为2 cm×4 cm，厚薄合适则可。低倍镜观察第1片痰液成分，顺着轨迹，从左到右浏览全片，并观察上皮细胞与孢子、真菌菌丝体、颗粒状物、螺旋体、白细胞、吞噬细胞、柱状上皮细胞、鳞状上皮细胞的关系。加入10% KOH溶液3滴到第2片上，加盖玻片，用低倍镜查找菌丝体与真菌孢子。瑞士染色处理第3片，准确分类各细胞。

1.2.5 判定痰液标本的合格性 按照痰液所含成分、形状和颜色综合判定痰液质量，显微镜低倍视野：白细胞指标＞25个、鳞状上皮细胞＜10个或白细胞/上皮细胞＞2.5个；唾液样需直接判定为不合格性标本，需重新留取包含食物残渣的标本。需检验并符合以下任何一项指标：（1）WBC指标高，脓性各色痰液；（2）暗红色、鲜红血性痰液；（3）浆液性或黏液性，白细胞指标＞25个、鳞状上皮细胞＜10个或白细胞/上皮细胞＞2.5个；（4）显微镜下存在大量细或粗颗粒状物，少见粒细胞成分。

1.3 指标判定

培养可疑：持续3天送检，各合格痰液内任意一种，2次或2次以上痰培养均属于同一菌株和三种培养基均可生长。生长阳性：持续三天送检，排除第三类合格痰液中任意一种，查见真菌孢子次数为3次，痰培养≥2次为三种培养基和同一菌株均可生长：（1）查见螺旋体次数≥1次；（2）嗜酸性粒细胞≥50%；（3）柱状上皮细胞≥2+/HP。协同阳性：持续3天送检，4类合格痰液中任意一种≥2次痰培养：（1）查见菌丝次数≥1次；（2）嗜酸性粒细胞≥10%。

1.4 统计学方法

研究计量和计数数据均用统计学软件（SPSS 13.0版本）分析，表示方式、（n，%），计数资料比较采用χ2检验，若P＜0.05，则判定结果存在统计学意义。

2 结果

2.1 痰液真菌培养种类分布

280例痰液标本中，阳性占比最高为念珠菌63.93%，其次为烟曲霉菌26.79%。见表1。

2.2 显微镜下其他真菌与曲霉菌的区别

曲霉菌菌丝分支分隔为锐角，无色素，2～4 μm宽度，孢子形状为圆形，且小。念珠菌菌丝为1～2μm宽，属于假菌丝，孢子形状为圆形，往往有出芽。毛霉菌菌丝体积较宽，分支为直角，2～8μm宽度。经临床诊断后共21例培养可疑，29例生长阳性，34例协同阳性。培养可疑、生长阳性、协同阳性三者两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。经检查后过敏性肺曲霉肺炎共6例，34例侵袭性肺曲霉菌病，45例肺曲菌球，给予痰液培养检查，对比肺曲菌球阳性率（17.78%）与侵袭性肺曲霉菌病（79.41%）、过敏性肺曲霉肺炎阳性率（83.33%），差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表1 痰液真菌培养种类分布[n（%）]

表2 各痰液培养标准对判定肺曲霉菌病的有效率

表3 不同肺曲霉菌病痰液培养阳性率[n（%）]

3 讨论

曲霉菌也称弗状菌，此为需住院接受治疗的系统性真菌。多在肾移植患者中发病，患者死亡率可达70%以上[3]。引发疾病的曲霉菌类包含黑曲菌、上曲菌、黄曲菌、烟曲菌等。肺组织为感染曲霉菌的一个好发器官。人类95%的曲菌病菌因烟曲菌而引发的[4]。本次研究表明，曲霉菌为痰液真菌培养阳性率第二位。

感染肺曲霉菌机理不同，痰液检出率不同：临床将肺曲霉菌分三个类型：侵袭性肺曲霉菌病、过敏性支气管肺曲霉菌病、慢性肺曲霉菌病。侵袭性肺曲霉菌多在各种器官移植、以及各种恶性肿瘤、HIV病毒感染、白血病等患者中发生。严重破坏肺组织，引发广泛性化脓性肺炎，合并形成脓肿，容易引发凝固性急性坏死，快速扩展，治疗难度大，其死亡率高。因病变位置排出脓性分泌物，给予痰液培养检出曲霉菌的可能性较大[5]，本研究中侵袭性肺曲霉菌病的培养阳性率达79.41%，与文献相符[6]。而在判定过程中随着判定标准的提升，特异性也有所增高，本研究中表2则明确体现了此点。慢性肺曲霉菌病包括：曲霉球、曲霉结节、慢性坏死性肺曲霉病、慢性空洞性肺曲霉菌病及慢性纤维化性肺曲霉菌病，其中肺曲霉球继发在肺结核空洞、肺脓肿、支气管扩张、支气管囊肿，繁殖于肺部空腔中，曲霉菌早期可因痰液排出人体外，形成晚期曲霉球，和支气管几乎不相通，给予痰液培养，检出曲霉菌的可能性亦明显降低。

建立痰液曲霉菌检验标准[7]：自然界中均广泛存在曲霉菌，曲霉孢子体积小，数量多，且在空气中的悬浮可能性较大，食物内污染可能性较大。且给予真菌培养痰液标本和显微镜检查痰液标本，具有随意性，导致真菌培养痰液存在容易污染到标本、标本取样不够规范性的问题，进而降低了曲霉菌阳性率。

解决以上问题的思路为留取痰液标本，并保存、检查、培养等过程，确保痰液标本合格，以免被曲霉菌孢子污染，采用足够量标本。采集标本前需漱口，并丢弃第一口痰液，降低痰液留取中污染性，痰液内多种培养基培养、多次连续培养、菌丝体为鉴别偶尔污染的指标。曲霉菌菌丝体仅在曲霉菌病灶位置繁殖可发生，散布在空气内孢子污染则不会发生菌丝体，给予显微镜观察可见较大菌丝体[8]。曲霉菌多次培养可将污染因素成功筛选出。痰液细胞、性状、颜色，以及有形成分均有利于判定痰液的病理意义，或是否合格。扁平磷状上皮多在咽部、口腔部位分布，纤毛柱状上皮则主要分布在各段支气管和主支气管部位。螺旋体多存在小支气管部位，呈凝固蛋白丝。嗜酸性粒细胞和中性粒细胞虽不属于肺部成分，但肺部过敏性病变痰液嗜酸性细胞会显著增多，如合并曲霉菌，表明存在肺曲霉菌病变应性支气管炎。肺部曲霉菌和细菌感染往往合并产生，当给予抗生素治疗，可降低痰液脓细胞，痰液往往存在坏死颗粒物质中。痰液定量显微镜涂片检查与培养，可提升曲霉菌检出可能性，避免发生漏检，尤其是给予KOH饱和液涂片检查，痰液内细胞成分被破坏掉，提升微小孢子和曲霉菌丝体检出率。

诊断肺曲霉菌疾病，按照是否合并基础性疾病，并结合实验室指标和影像学状况实施分级、综合诊断。但各检查方式均具有一定限制性。将组织病理检查和无菌位置曲霉菌培养作为金标准。但危重患者，不易得到活检标本，培养血液标本的阳性率较低。综上，痰液检验在诊断肺曲霉菌病中作用明显，可早期准确判定肺曲霉菌病，以便及时给予有效诊治，降低疾病死亡率，值得推广。