MMP-2，MMP-9和E-cadherin在皮肤恶性黑素瘤中的表达及意义

万慧颖，徐敏燕

（四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所，成都610031）

皮肤恶性黑素瘤是一种起源于表皮正常黑素细胞的恶性肿瘤，其恶性程度高，发展迅速且预后较差。浸润及转移是其重要的生物学行为，肿瘤细胞向周围组织浸润，并远处转移，需具备降解细胞外基质的能力。

基质金属蛋白酶家族（MMPs）是细胞外基质降解必须的锌离子依赖性内源性蛋白酶，能够特异性降解基底膜的成分[1]。MMPs中的明胶酶是唯一能够降解基底膜和细胞外基质中的Ⅵ型胶原成分的酶，其中的MMP-2和MMP-9发挥着重要的作用，可以使肿瘤细胞易于突破结构屏障，与肿瘤内血管生成、侵袭及转移相关[2]。上皮型钙黏附蛋白（E-cadherin）是重要的上皮细胞黏附分子，E-cadherin黏附功能的丧失与肿瘤细胞的发生发展、侵袭过程密切相关[3]。目前也有研究表明，细胞膜表面的E-cadherin与MMPs在代谢方面有相关性[4]。因此本研究采用免疫组织化学方法检测恶性黑素瘤及色素痣组织中MMP-2、MMP-9和E-cadherin的表达，探讨与恶性黑素瘤的发生和转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 32例标本均来自四川省人民医院皮肤病性病研究所2008年—2014年确诊为恶性黑素瘤患者的皮损组织（石蜡包埋组织块），其中男18例，女14例，年龄36～78岁，平均57岁，所有标本均行病理组织学检查并经2位皮肤病理医生明确诊断。按照有无淋巴结转移分为2组，有淋巴结转移者18例，无淋巴结转移者14例。另设10例确诊为色素痣的组织为对照组。

1.2 仪器及试剂 德国SHANDON组织包埋机由德国SHANDON公司生产，Yamato病理组织切片机由日本大和光机工业株式会社制造。兔抗人MMP-2和MMP-9多克隆抗体购自武汉博士德公司，鼠抗人E-cadherin单克隆抗体和SP试剂盒购自福州迈新公司。

1.3 实验方法与步骤 采用免疫组化SP法染色和DAB显色，用已知MMP-2、MMP-9和E-cadherin阳性的组织切片作实验阳性对照，相同切片以PBS代替一抗作空白对照。实验步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，将其放进水浴锅中（100℃）40 min进行抗原热修复，加3%过氧化氢孵育20 min以消除内源性过氧化物酶活性。分别滴加MMP-2、MMP-9和E-cadherin一抗工作液（工作浓度 1∶100），4℃冰箱中过夜，再按试剂盒说明书进行操作，DAB显色，光镜下控制，显色充分后用自来水终止。苏木精复染1 min，常规梯度脱水至封片。

1.4 结果判断 MMP-2和MMP-9主要表达于细胞浆内，部分胞膜也有表达，出现棕黄色或棕褐色反应物颗粒即为阳性。E-cadherin主要表达在细胞膜及部分胞浆上。显微镜下随机检测5个独立高倍视野（×400倍），统计阳性细胞数并记录阳性细胞率。根据阳性细胞染色程度及染色细胞所占百分率进行综合评分。无任何细胞着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞数≤5%判定为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。每张切片的平均着色程度与平均阳性细胞百分率得分相加，得分≤1分者为阴性（-），2～3分者为弱阳性（+），4～6分者为阳性（++），＞6分者为强阳性（+++）。所有的结果均由2位皮肤病理医生进行双盲读片决定。

1.5 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行统计学分析，各组样本间的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2免疫组化染色结果 MMP-2阳性反应主要定位于细胞浆，部分胞膜也有表达，阳性着色呈淡黄色至棕褐色。MMP-2在恶性黑素瘤组织中阳性表达明显高于色素痣对照组，差异有统计学意义（χ2=26.98，P=0.001，P＜0.01），见表 1、图 1。

表1MMP-2免疫组化染色结果 例

图1 MMP-2在恶性黑素瘤中主要表达于细胞浆，部分胞膜也有表达（SP染色×400）

2.2 MMP-9免疫组化染色结果 MMP-9阳性反应主要定位于细胞浆，部分胞膜也有表达，阳性着色呈淡黄色至棕褐色。MMP-9在恶性黑素瘤组织中阳性表达明显高于色素痣对照组，差异有统计学意义（χ2=20.91，P=0.001，P＜0.01），见表 2、图 2。

表2MMP-9免疫组化染色结果 例

2.3 E-cadherin免疫组化染色结果 E-cadherin阳性反应定位于细胞膜及部分胞浆，阳性着色呈淡黄色至棕褐色。E-cadherin在恶性黑素瘤组织中阳性表达明显低于色素痣对照组，差异有统计学意义（χ2=7.75，P=0.005，P＜0.01），见表 3 及图 3、4。

图2 MMP-9在恶性黑素瘤中主要表达于细胞浆，部分胞膜也有表达（SP染色×400）

表3 E-cadherin免疫组化染色结果 例

图3 E-cadherin在恶性黑素瘤中主要表达于细胞膜及部分细胞浆（SP染色×400）

2.4 MMP-2、MMP-9和E-cadherin在有淋巴结转移的恶性黑素瘤中的表达 MMP-2与MMP-9在有淋巴结转移的恶性黑素瘤中阳性表达率均高于无淋巴结转移者（P＜0.05，P＜0.01）。E-cadherin在有淋巴结转移者中阳性表达率低于无淋巴结转移者（P＜0.05），见表 4。

表4MMP-2、MMP-9、E-cadherin在恶性黑素瘤中的表达 例

3 讨论

皮肤恶性黑素瘤可以广泛浸润表皮、真皮及皮下组织，甚至浸润相邻器官或组织，并易于侵入血管和淋巴管向远处转移，其发展迅速，预后差，死亡率高。近年来随着分子生物学和人类基因组学的发展，研究肿瘤发生侵袭和转移的机制，针对肿瘤转移的相关蛋白的研究，对早期诊断与治疗，判断预后均具有重要临床意义。

MMPs是一类能够降解血管基底膜，水解细胞外基质及其他基质成分的重要蛋白酶，具有促进肿瘤侵袭及血管形成等关键作用。目前，已经有20余种MMPs被发现，按照其作用底物不同可以分为4大类：胶原酶、明胶酶、基质降解素和膜型MMPs[5]。多项研究证实，在上皮源性肿瘤组织中，如肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤等，均分别发现MMPs的高表达与肿瘤的转移和预后不良有密切关系[6]。明胶酶的2个亚型，MMP-2和MMP-9，分子质量分别为72 kD和92 kD。MMP-2不仅可以降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原，有利于肿瘤细胞扩散，还可以通过新生毛细血管促进肿瘤侵袭与转移[7]。MMP-2的阳性率随着TNM分期逐渐增加，有淋巴结转移的患者阳性表达率高于无淋巴结转移的患者[8]。MMP-9是MMPs中分子量最大的酶，它以酶原形式分泌，能水解细胞基底膜及细胞外基质中Ⅳ型、Ⅴ型胶原和纤维连接蛋白成分，导致基底膜破坏，肿瘤细胞浸润结缔组织、小血管和淋巴管而发生转移[9]。

本研究发现，恶性黑素瘤中MMP-2和MMP-9的表达均显著高于色素痣，并且与淋巴结的转移呈正相关性。国内余忠平[10]研究发现，MMP-9在转移性黑素瘤中阳性表达率显著高于原位黑素瘤与色素痣。张娟等[11]研究报道，MMP-9在皮肤恶性黑素瘤中的阳性表达率高于交界痣和正常皮肤组织，并随肿瘤浸润深度的增加而增高，且有淋巴结转移者阳性表达率大于无淋巴结转移者。均与笔者的研究结果一致。

E-cadherin蛋白主要存在于人和动物的上皮细胞中，是钙黏附蛋白分子家族中的一种跨膜糖蛋白。E-cadherin蛋白通过N端胞外区钙离子依赖的同型黏附与邻近细胞形成连接体，以维持细胞的极性，因此其在细胞的黏着连接处集中表达，可以有效地维持上皮细胞的形态和组织结构。E-cadherin蛋白在肿瘤早期浸润中有调控作用，其表达下调或缺失会导致肿瘤细胞连接松散，表达较强的侵袭能力[12]。E-cadherin蛋白表达下调的患者，其生存率下降，可能就是由于肿瘤细胞脱离了原发灶，沿淋巴管、血管及组织间隙浸润并转移，导致死亡率增高[13]。有较多的研究显示，E-cadherin蛋白表达强度与患者的年龄、性别及病理类型无关，但与不同TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况有显著相关性。在有淋巴结转移、临床TNM分期晚和肿瘤分化程度差的组织中，E-cadherin蛋白表达显著下调或缺失，从而使肿瘤细胞之间的黏附力下降，导致恶性肿瘤的浸润和转移[14]。这与笔者的研究结果也是完全一致的。

综上所述，MMP-2和MMP-9在恶性黑素瘤中高表达，E-cadherin蛋白在恶性黑素瘤中低表达，可能与恶性黑素瘤的发生、发展、分化和转移过程相关，联合检测可以作为评估肿瘤侵袭性的指标，但其参与肿瘤侵袭转移的复杂作用及具体机制仍需要进一步的研究，这些机制的深入研究将对临床治疗与预后判定具有重要的意义。

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