尼古丁增强肺癌细胞耐药性与Bcl-2家族蛋白的关系*

赵劲风，史夏青，王成志，杨满意，刘玲，廖明媚

（中南大学湘雅医院 卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南 长沙 410008）

肺癌是世界最常见的癌症之一，因其确诊较晚，导致预后不良，发病率和病死率持续上升，已是我国癌症病死率的第1位[1]。吸烟会大幅增加吸烟者患肺癌的风险，且导致约90%的肺癌患者死亡[2]。香烟烟雾是包含超过4 000多种化学物质的复杂混合物，大部分是有害物质或致癌物，包括尼古丁、芳香烃、醛及氰化物等[3]。尼古丁是香烟烟雾中以酸盐形式存在的主要化学成分，在肺部吸收，被认为是吸烟成瘾的主要因素[4-5]。

近年来的文献报道[6-7]，肺癌治疗的效果可被尼古丁所影响，其作用机制为尼古丁通过调控细胞内各种不同信号通路来促进肺癌细胞增殖、侵袭和血管生成，并抑制肺癌细胞的凋亡。例如：尼古丁可以从肺癌细胞的乙酰胆碱受体上取代乙酰胆碱，导致Ca2+内流，并激活PI3K，AKT，MAPK，PKC等蛋白激酶，促进增殖，使癌细胞凋亡减少[8]。本文主要阐述尼古丁影响B细胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/leukelia-2,Bcl-2）家族蛋白的表达进而促进肺癌的发展并降低化疗药物的敏感性。

1 尼古丁的化学性质及作用

尼古丁是烟草的主要成分，它含有1个吡啶基和1个吡咯环，2个结构上都带有1个叔胺，可以在烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的多个位置选择性结合。人体大脑、肺、神经肌肉接头、肾上腺髓质和神经节等都有nAChRs[9]。当尼古丁经吸烟吸入时，通过肺部扩散进入循环，最终进入大脑刺激多巴胺释放，使吸烟者感觉十分愉悦，所以尼古丁是吸烟成瘾的主要原因[4]。

在烟草加工和吸烟时尼古丁可以通过亚硝化作用转化为4-甲基亚硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁酮、4-甲基亚硝胺-1（3-吡啶基）-1-丁醇（NNK）和N-亚硝基去甲基尼古丁（NNN），入机体后迅速的被吸收并分布到整个机体[10]。尼古丁及其衍生物（NNK，NNN）可诱导各种癌细胞（包括肺、胰腺、膀胱、头、颈和神经胶质）的存活、增殖、迁移及侵袭等[11]。尼古丁通过激活癌细胞上的nAChRs，进而激活或直接增强下游抗凋亡信号通路级联反应，促进肿瘤生存，抑制癌细胞凋亡[12]。

2 肺癌耐药性的产生及机制

化疗成为治疗中晚期肺癌的重要手段[13]，可以提高肺癌患者的生存率，减轻症状，提高生活质量。但是在化疗过程中，肺癌细胞对化疗药物容易产生耐受性，导致化疗失败，这加剧了肺癌患者的不良预后从而导致高病死率[14]。近年来研究表明[14-16]，肺癌耐药的产生与肿瘤细胞DNA修复、细胞信号传导中相关因子（PKC、PI3-K/AKT、NF-κB等）及凋亡相关基因（P53、Survivin、Bcl-2基因家族等）的表达异常存在密切联系。

3 尼古丁增强肺癌耐药性与Bcl-2家族蛋白的关系

3.1 Bcl-2家族与细胞凋亡

Bcl-2这一基因家族主要与细胞凋亡有关，可以调控线粒体膜通透性，释放凋亡因子细胞色素C和激活Caspase级联反应等，是细胞凋亡过程中重要的调控因子[17]。Bcl-2蛋白家族可以分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，促凋亡蛋白由BH123和BH3-only 2个亚族组成，BH123亚族主要包含Bak和Bax，而BH3-only亚族包括Bid、Bim、Bad、Bik、Puma和Noxa；抗凋亡蛋白由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等组成[18]。细胞没有凋亡刺激时，抗凋亡蛋白在线粒体外膜上结合BH123蛋白和Bak、Bax，从而抑制其活化，所有抗凋亡蛋白都可以隔离Bax，而只有Mcl-1和Bcl-xl可以结合Bak。细胞在接受凋亡刺激之后，BH3-only蛋白部分与抗凋亡蛋白结合，使抗凋亡蛋白不能再与BH123蛋白相互作用，或直接与BH123蛋白结合以激活它们。活化的Bax和Bak同二聚化，诱导细胞色素C和其他膜间蛋白释放到细胞质中，使半胱天冬酶激活，然后是DNA片段化，最终导致细胞死亡[6，17，19]。因此，Bcl-2家族蛋白的表达及其之间的相互作用可以影响细胞凋亡。

3.2 BH123亚族与尼古丁增强肺癌耐药性的关系

3.2.1 BH123亚族的结构与功能 Bax和Bak是Bcl-2基因家族中具有BH1-3同源结构区域，对细胞凋亡起促进作用的BH123亚族成员，是细胞内源性凋亡途径（包括DNA损伤）必不可少的凋亡诱导因子[20]。在正常生理状态下，Bax主要以单体形式位于细胞质中或吸附在线粒体外膜上，可形成Bax/Bcl-xl、Bax/Bcl-2异二聚体；Bak不同于Bax，大多数Bak以Bak/Mcl-1、Bak/Bcl-xl异二聚体的形式吸附在线粒体外膜上。细胞凋亡发生时，Bax和Bak均吸附到线粒体膜上，形成寡聚体，促进凋亡[21]。

3.2.2 BH123亚族与尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药的研究 大多数肺癌细胞系都可检测出高水平的内源性Bax和Bak，且在肺癌细胞死亡时表达很高。其中，Bax已被确定可以作为肺癌治疗的预后指标，为肺癌治疗提供了一个新靶点[22]。尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药主要与Bax有关，与Bak关系的相关研究甚少。在凋亡过程中，Bax的促凋亡活性可以通过调节磷酸化，翻译后修饰水平来调控。Bax的磷酸化S184位点位于其疏水羧基末端，调控Bax在细胞内的定位及其插入线粒体膜的能力[23]。尼古丁可以激活Bax的激酶AKT，AKT与Bax在细胞内共同作用，并且使Bax磷酸化。Bax的磷酸化使其不能结合到线粒体膜上，从线粒体进入细胞质，且Bax蛋白的半衰期减短。尼古丁还可以激活Bax的激酶PKC，PKC可直接在肺癌细胞中磷酸化Bax。因此，尼古丁诱导的肺癌细胞的生存与耐药性是通过激活PI3K/AKT通路实现的，使Bax磷酸化失去促凋亡功能[23-24]。

目前已经发现了特异性靶向的Bax激动剂SMBA1-3，可以在Bax的S184位点处结合引起Bax构象变化，促进Bax寡聚化，导致肺癌细胞凋亡[25]。对于Bax磷酸化，发现蛋白磷酸酶2（PP2A）可作为一种Bax调节性磷酸酶发挥作用，不仅使Bax去磷酸化，而且激活Bax促凋亡功能[26]。因此，SMBAs和PP2A可以作为一种潜在的靶向Bax的新型抗癌药物，专门用于治疗肺癌。

3.3 BH3-only亚族与尼古丁增强肺癌耐药性的关系

3.3.1 BH3-only亚族的结构与功能 BH3-only亚族蛋白只有1个保守的BH3结构区域，包括Bid，Bim，Bad，Bik，Puma和Noxa等，通过线粒体凋亡途径启动细胞凋亡程序的，在凋亡的启动及凋亡通路的沟通中发挥着极其重要的作用[27]。BH3-only蛋白主要通过结合抗凋亡蛋白并抑制其活性，使Bax和Bak释放，引起线粒体外膜透化，激活半胱天冬酶的级联反应，引起细胞凋亡[28]。

3.3.2 BH3-only亚族与尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药的研究 BH3-only亚族蛋白成员Bad、Bim、Puma和Noxa在肺癌细胞中均可检测到有表达。Bad在大多数肺癌细胞系中都有高表达，且与其生存和耐药有很大关系。Bim的表达水平的降低或Bim缺失多态性的存在会降低肺癌治疗效果，且影响术后患者的预后。而Puma和Noxa在肺癌细胞中的表达与其发病机制可能并没有很重要的关系[29]。

尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药主要与Bad相关。Bad是BH3-only亚族中的一个重要蛋白，可以在S112，S136和S155 3个位点发生磷酸化，其促凋亡活性主要与磷酸化水平相关[30]。据报道，尼古丁可以激活肺癌细胞内的MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶，引起Bad先后在S112，S136和S155 3个位点磷酸化，磷酸化的Bad不再与Bcl-2或者Bcl-xl结合，从线粒体膜上转移至细胞质，并与细胞质中的14-3-3蛋白相互作用，失去其促凋亡活性[31]。

近年来，也有文献报道针对MAPK ERK1/2，AKT和PKA等激酶活化的抑制剂。PD98059和U0126是常见的MAPK ERK1/2激酶抑制剂[32]。AKT位于PI3K-AKT信号转导通路的核心位置，在调控细胞凋亡、增殖和代谢等多种生理活动中发挥重要功能，已有十几个AKT小分子抑制剂进入临床开发阶段，如：LY294002，哌立福新，MK2206，GSK2110183等[33-34]。H89是已经证明可以在肺癌细胞中抑制PKA激酶活化。这些对于激活Bad磷酸化的蛋白激酶有显著抑制效果的分子抑制剂，均可作为潜在的肺癌治疗药物[35]。

3.4 抗凋亡蛋白与尼古丁增强肺癌耐药性的关系

3.4.1 抗凋亡蛋白的结构与功能 抗凋亡蛋白Bcl-2基因家族中具有BH1-4同源结构区域，由Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-b和A1等组成。抗凋亡蛋白可以直接与Bax或Bak结合使其失活，并且可以竞争性的与BH3-only蛋白结合抑制其发挥凋亡活性，从而减少细胞凋亡[36]。一些恶性肿瘤细胞通过提高Bcl-2家族的抗凋亡蛋白表达来逃避凋亡，进而过度增殖。因此，抗凋亡蛋白成为抗癌治疗的可能靶点。

3.4.2 抗凋亡蛋白与尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药的研究 抗凋亡蛋白在肺癌细胞耐药性产生过程中起到了重要的作用，抗凋亡蛋白通过抑制肺癌细胞的凋亡、延长细胞生存时间等机制，诱导肺癌细胞对化疗药物产生耐药性。因此，抗凋亡蛋白在肺癌细胞中均过表达，其中Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1的表达最为显著。目前关于尼古丁诱导肺癌细胞的生存与耐药的研究大部分与Mcl-1和Bcl-2这2个蛋白相关[12]。

Mcl-1是Bcl-2家族成员中一种独特的抗凋亡蛋白，具有较短的半衰期和短期抗凋亡功能。在凋亡过程中，Mcl-1通过抑制Bax、Bak、BH3-only蛋白起负调控内源性凋亡的作用[37]。Mcl-1表达在多个水平上受到严格调控，包括转录，转录后和转录翻译后过程，在许多肿瘤中过表达，Mcl-1的高表达与肿瘤耐药和复发密切相关[38]。Mcl-1在各种人类肺癌细胞中广泛表达，与肺癌细胞的增殖与耐药有重要关系。尼古丁上调Mcl-1在各种人类肺癌细胞中的表达水平，还通过上游β-肾上腺素受体激活ERK1/2通路，其诱导Mcl-1可以在PEST区域的T163位点磷酸化。在尼古丁诱导Mcl-1的T163位点处磷酸化显著延长Mcl-1的半衰期，从1.5～2.2 h延长至5～6 h，导致肺癌细胞长期存活和对化疗药物的耐药性[11，39]。因此，Mcl-1的抗细胞凋亡功能的破坏可以通过阻断其T163位点磷酸化，代表治疗烟草相关癌症的新策略，尤其适用于肺癌和其他Mcl-1高表达的恶性肿瘤。

Bcl-2是肺癌细胞程序性死亡的关键调节蛋白，研究表明长期吸烟的肺癌患者的癌细胞中可以检测到高表达的Bcl-2，因此Bcl-2与肺癌之间有密切的关系。尼古丁可以上调肺癌细胞的Bcl-2的表达，使肺癌细胞对凋亡刺激的敏感性降低，且对于化疗药物的耐药性增加[22]；尼古丁对于Bcl-2的调节还表现在磷酸化水平，Bcl-2可以在T69，S70和S87多个位点发生磷酸化，S70位点是尼古丁诱导Bcl-2发生磷酸化的主要位点，且尼古丁通过激活PKCα和MAPK ERK1/2激酶激活Bcl-2在S70位点的磷酸化[17]；此外，尼古丁诱导Bcl-2磷酸化还可以增强Bcl2/Bax异源二聚化，阻断Bax的促凋亡作用。在化疗药物治疗肺癌的过程中，Bcl-2与Keap1结合，促进Bcl-2泛素化并且降解，尼古丁可以抑制Bcl-2与Keap1的相互作用，减弱Bcl-2泛素化，增强Bcl-2稳定性[40]。

Bcl-2蛋白在肿瘤细胞中的表达大大高于在正常细胞中的表达，也就是说以其为靶点的抑制剂几乎不会对正常细胞产生影响，通过抑制Bcl-2抗凋亡蛋白来克服肺癌细胞对凋亡的耐受是一种基于肿瘤发病机制的治疗方案，比传统的细胞毒性疗法选择性好、安全性高[41-42]。目前关于Bcl-2蛋白的抑制剂也有很多，比如：ABT-737，ABT-263，VENETOCLAX等[43]。除Bcl-2外，针对其他抗凋亡蛋白的小分子抑制剂也在研究中。这类针对抗凋亡蛋白的小分子抑制剂不仅在肺癌的治疗中前景巨大，在其他肿瘤的治疗中也是一个重要选择。

肺癌的病因至今仍未能完全的阐明，造成其发生的危险因素有很多，其中，吸烟是确认的与肺癌发生有关系的最重要因素[44]。尼古丁对肺癌治疗效果有严重的影响，尼古丁及其代谢产物可以通过活化乙酰胆碱受体进而激活下游Src、Ras-Raf-MAPK-MEK和PI3K/AKT信号通路，进一步推动Bcl-2基因家族蛋白的表达。本文主要阐述了尼古丁诱导Bcl-2和Mcl-1磷酸化，磷酸化增强其抗凋亡功能；而对于促凋亡蛋白Bax和Bad的磷酸化，磷酸化使其促凋亡功能失活，这些都有助于增加人类肺癌细胞的生存和化疗耐药性。基于尼古丁对Bcl-2基因家族蛋白的影响的研究，专门针对该蛋白磷酸化的分子抑制剂可以作为肺癌治疗的研究对象，为肺癌治疗提供一种新的途径，从而尽可能做到早干预，抗耐药，以提高肺癌的治疗效果。同时，对于肺癌的所有研究均显示尼古丁诱导肺癌细胞对化疗药物的耐药性仍然只是部分的，表明仍有其他因素导致肺癌细胞不断增殖且对化疗药物产生耐药性，发现并寻找这些因素，并且研究该因素对于细胞内部凋亡通路的影响，将对肺癌的临床治疗应用具有指导意义。