植物人工种子包埋基质研究进展

郑惠元，王英平，雷秀娟

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

人工种子是1978年由Murashige[1]首次提出的，自提出以来，就引起国内、外很多国家的重视。1985年，欧共体把人工种子列入“尤里卡”计划；我国在1987年也将其列入“863”高新技术发展计划，并在胡萝卜、苜蓿、芹菜等模式作物的人工种子制作技术中取得了重要进展；日本将人工种子的研究范围扩大到重要的粮食作物水稻和蔬菜等作物[2]。为提高人工种子的萌发率和成苗率，人们致力于人工胚乳的研究，并取得了很好的效果。要想制作出符合机械化生产的人工种子，外种皮的研制尤为重要。为延长人工种子的贮藏时间，增强人工种子的抗菌能力，需要在人工胚乳中加入提高繁殖体耐性的成分。因此，包埋基质的研究不论是对提高人工种子的萌发率和成苗率还是在人工种子的贮藏和防腐研究中都具有重要意义。

1 人工种子的概念及特点

人工种子是指将植物离体培养后产生的体细胞胚或分生组织包埋在含有养分和保护功能的物质中，在适宜条件下萌发成苗的球状结构。它具有同天然种子类似的结构，由人工种胚、人工胚乳和人工种皮3部分组成，故又称作合成种子或种子类似物[3]。

人工种子属于无性繁殖，具有固定杂种优势、保持优良品种、缩短育种年限等优点。此外，与一年一度的天然育种相比，人工种子的生产不受季节性限制，还能根据植物的不同品种和各种环境因素，人为地在包埋基质中添加农药、生物肥料、有益微生物、植物激素等物质，以增强植物在不同环境中的抗逆性，促进植物生长；在繁殖苗木、人工育林等方面，人工种子比试管育苗繁殖成本更低，节省了人力、物力和财力。

2 人工种子的包埋基质及方法

2.1 人工胚乳

人工胚乳介于人工种皮和胚状体之间，为人工种胚提供有机物和无机盐等物质，这些营养物质能够促进人工种子的生长发育。人工胚乳所含的物质是体细胞胚萌发的培养基成分，主要有MS培养基、N6培养基[4]、B5培养基[5]和SH培养基[6]。除此之外，还需要在人工胚乳中添加适当的碳源，一方面，碳源能够维持球状胶囊内外的渗透压；另一方面，体胚在生长和分化成苗的过程中也需要来自于人工胚乳所提供的碳源。目前，常用的碳源有蔗糖、果糖、麦芽糖和淀粉，需要根据植物自身的特性选择其所适宜的碳源。叶志毅等[7]以蔗糖和果糖作为碳源包埋桑树体细胞胚，当果糖的浓度为20g/L时，人工种子的发芽率和茎发生率都只有22%；把碳源换为30g/L的蔗糖后，发芽率达100%、茎发生率达89%。郭顺星等[8]用麦芽糖作为铁皮石斛原球茎的碳源时，存活率达到64%。刑小黑等[9]在研究水稻釉粳人工种子时发现，用麦芽糖作为碳源更有利于水稻釉粳不定芽的萌发。黄绍兴等[10]在研究木薯淀粉时发现，淀粉分子具有多孔状的结构，这样的特性恰好改善了海藻酸钙的致密结构影响明胶颗粒透气性、保水性和吸水性差的问题。此外，不同的碳源浓度也影响着人工种子的萌发，研究发现，一定范围内提高人工胚乳中的蔗糖浓度能够增加猕猴桃人工种子的萌发率[11]。

为提高人工种子的萌发率，程力辉等[12]研究表明，在半夏人工胚乳中添加萘乙酸和赤霉素，萌发率达到84%。添加适宜的生长调节剂有利于繁殖体的萌发和生长，若增强植物的抗逆性还需添加杀菌剂、防腐剂、抗生素等提高植物抗逆性的物质[13]。Kumar等[14]为抑制杂交稻人工种子萌发环境的微生物，在人工胚乳中添加适量的多菌灵和链霉素，对胚乳的发芽和转化没有影响。薛建平等[15]在半夏人工胚乳中添加1%的多菌灵，25℃贮藏30d，萌发率可达到65%，表明多菌灵在对人工种皮霉菌的滋生方面起到了一定的延缓作用。

2.2 人工种皮

人工种皮分为内种皮和外种皮2种，对于内种皮的选取应具备以下条件：内种皮的成分应对繁殖体无毒、无害，具有生物相容性，能支持胚；能与外界环境交换气体，具有保持水分及营养物质和保护剂的能力；具备一定的机械强度，保持明胶颗粒的完整性，既不阻碍人工种子的正常萌发，在人工种子的贮藏、运输和播种中对胚状体起到保护作用；能被生物降解，对其他植物和环境不造成伤害和污染。

海藻酸钠具有良好的通透性、生物活性、价格低廉、无毒害等优点，常被用作包埋基质中的内种皮。但在人工种子制作过程中，仅仅使用海藻酸钠作为内种皮仍存在易粘连、易失水、吸水回涨性差等问题。因此，为提高人工种子的成苗率，结合海藻酸钠研制复合包埋基质成为人们研制人工种皮的新热点。Timbert等[16]发现，添加多糖、树胶、高岭土后的海藻酸钠保水性增加，对干燥处理过的胡萝卜体细胞胚的活力恢复也起到了积极的促进作用。薛建平等[17]在海藻酸钠中添加赤霉素、苯甲酸钠、多菌灵、Cl2O和壳聚糖等制成的复合人工种皮，萌发率可达95%。张明生等[18]在海藻酸钠中添加2.0%的壳聚糖为半夏人工种皮基质，在4℃贮藏20d，发芽率和转化率分别达到82.8%和78.6%。

目前，内种皮的研制还仅限于无菌条件，且仅有内种皮包埋的人工种子不利于机械化播种，要想同自然种子一样能够正常贮藏、包装和运输，还有赖于人工外种皮的研制。Redenbaugh等[19]采用ElvexTM-4260作为外种皮的材料，这种材料能有效地防止营养物质渗漏和胶囊间黏连，同时，还具有保持水分和抑制干缩等优点，制作出的人工种子机械强度较高，有较高的萌发率，但未见成苗的报道。Ling[20]以海藻酸钠为内层基质，壳聚糖为外层基质包埋油菜次生胚状体时，实现了100%的萌发率，但在有菌条件下的发芽率仍然不高。George[21]试用硅胶制作的谷子人工种子，其发芽率达82%，4℃贮藏14d后，体胚仍可萌发。

包裹人工种子的外种皮不仅可以提高人工种子的保水力、防止胚乳中的营养外渗，还可以减少土壤中的微生物、温度和pH值等环境因素对人工种子的萌发率、成苗情况的影响。同时也便于人工种子的运输、贮藏和播种。

2.3 人工种子的包埋

虽然现在已经有国家研制出了人工种子包埋机，但还没能完全替代手工包埋，还有许多需要改进的地方。目前，主要的包埋方法有液胶包埋法、干燥法和水凝胶法。液胶包埋法是将粘滞流体胶中悬浮的胚状体直接播种于土壤中，Drew[22]用此法将胡萝卜的体细胞胚播种于无糖的基质上，成功获得了3颗植株。干燥法是指用聚氧乙烯等聚合物包埋干燥过的体细胞胚，此法有利于人工种子的贮藏，Redenbaugh等[19]首次用该方法包埋苜蓿体细胞胚，成苗率达86%，证明了干燥法包埋体细胞胚的有效性。水凝胶法是指通过离子交换或温度突变将繁殖体包埋起来，形成球形的凝胶颗粒，目前，最常用的是离子交换法，即将海藻酸钠中悬浮的体细胞胚滴入 CaCl2溶液后发生离子交换反应，形成球状胶囊。

3 人工种子的贮藏

因农业生产的季节性限制，包埋出的人工种子不一定能及时用于生产，人工种子的含水量高，易失水干缩，这极大地增加了人工种子的贮藏难度。想要解决该技术的关键问题还在于完善人工种子的包埋基质。目前，研究的贮藏方法有低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡法、超低温液氮保存及上述方法的组合[23]，报道最多的是低温法和干燥法的结合。

干燥法实质上是模拟天然种子经过脱水等生理变化进入休眠的过程。干化能使胚状体的生长停滞，同时人工种子幼苗的活力也有所提高[24，25]。崔红等[26]发现，干化使贮藏期间芹菜体胚的细胞膜结构不被破坏，保持了细胞内环境的相对稳定。Gray等[24]研究报道，在相对湿度70%的条件下，脱水贮存葡萄体细胞胚，21d后的萌发率为34%。Hammatt等[27]研究表明，脱水处理过的大豆的体胚萌发率显著增加。Takahata[28]将脱落酸处理过的子叶期甘蓝体胚脱水至含水量为10%，在室温条件下保存3个月后仍能转化成苗，并在形态和倍性水平上均与未干化的体胚无显著差异。

干化对细胞组织有一定的伤害作用，为降低这种损伤，Timbert等[16，29]用高浓度的蔗糖、脯氨酸和ABA预处理体胚，脱水耐性在一定程度上有所提高。Choi等[30]报道了蔗糖预处理高丽参体胚后延长了体胚的休眠时间。Timbert等[16]发现，经脯氨酸预处理后的胡萝卜体胚其自身的抗逆性有所增加。Roberts等[31]发现，与13%和20%的甘露醇相比，脱落酸能更好地促进云杉子叶期体细胞胚中贮藏蛋白及可溶性糖等脱水保护物质的积累，干化后的体胚发芽率能达到83%。

此外，4℃低温储藏法，有效地抑制了胚状体的萌发，延缓芽的生长。Kumar等[32]将蝶豆的合成种子在4℃下保存5个月后，仍然有86%的存活率，并均发芽成功转移到土壤中。

4 人工种子的防腐

防腐是实现人工种子在田间应用的关键技术之一，人工胚乳中含有糖类等有机物，这些营养物质暴露于大田这种开放的系统中，除了快速失水之外，还会遭受细菌、真菌、病毒等的侵染，要想使人工种子在萌发前不腐烂，还需要进一步改善包埋基质。柯善强等[33]在黄莲人工种皮中加入防腐剂，有菌条件下其萌发率和成苗率均显著提高。汤绍虎等[34]在甘薯人工种皮中加入400mg/L～500mg/L的先锋霉素、多菌灵、安苄青霉素或羟基苯酸丙酯，均在不同程度上表现出抑菌作用，在MS培养基上的萌发率提高了4%～10%。陈德富等[35]在苎麻人工种皮中添加100mg/L的青霉素和0.1%克拉霉素作为防腐剂，播种到沙石肥土中，发芽率达15.3%，生根率为8.2%。

5 小结

自人工种子提出以来，在稳定园林珍稀花卉物种、保存濒危药用植物资源、快繁脱毒果树苗木等方面起到了重要作用。人工种子所具有的繁殖成苗快、不受季节限制、固定杂种优势等特点为种子的培育开辟了一条新途径。不过，人工种子的研制存在着许多问题，例如，制作费用较高、包埋基质不够成熟、离实现大量制种和田间播种以及规模化生产还有一定的差距。这就更需要人们根据不同的植物和用途对人工胚乳和种皮不断地改进和探索，提高人工种子的萌发率和成苗率，延长人工种子的贮藏时间，增强人工种子在自然环境的耐性，为人工种子的推广奠定基础。

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