多肽类药物药代动力学特点及其代谢机制研究进展

丁海波，金莉莉，王秋雨

（辽宁大学生命科学院，辽宁沈阳 110036）

多肽类药物在分子结构和理化特性上不同于小分子药物，多为亲水性的极性大分子，是体内广泛分布的蛋白酶的底物。由于其药效显著，用药剂量低以及毒副作用小等特点，已被广泛应用于各类疾病的防治。目前，经FDA批准上市的肽类药物已达60多种，在药物市场占有相当大的比重，如胰岛素（insulin）、催产素（oxytocin）、波西普韦（boceprevir）、达托霉素（daptom ycin）、艾塞那肽（exenatide）、恩夫韦地（enfuvirtide）、奥利万星（oritavancin）、替考拉宁（teicop lanin）和万古霉素（vancom ycin）等［1-2］，主要用于治疗传染性疾病、癌症和代谢性疾病等［2-4］。截止到2015年，已有约140种多肽类药物进入了临床试验，＞500种多肽药物正处于临床前研究阶段［5］。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂作为治疗2型糖尿病（type 2 diabetes me llitus，T2DM）的一类多肽，是肽类新药的研究热点之一，目前众多GLP-1受体激动剂正处于临床与临床前研究阶段［5-6］，其中部分预计即将上市。对于新型多肽药的开发，目前仍主要通过对已上市药物的化学衍生来实现，其在克服抗药性方面尚无实质性进展［7］。另外，在新药开发过程中，针对多肽药物如何精确地定量分析还存在众多技术难题。

在药物研发过程中，药动学研究与药效学和毒理学研究处于同等重要的地位。充分了解多肽药的药动学特征和代谢机制可有效地指导多肽的合成与结构优化，对药物的发展及临床应用具有重要意义。由于多肽的结构、相对分子质量和亲水性等特征多样而具有不同的代谢机制，主要包括肽酶降解、内吞消除、靶点介导的消除和肾小球过滤等，一般认为以酶解消除和肾小球过滤为主。本文从给药吸收途径、体内转运分布方式和药物消除机制3方面阐述多肽类药物的研究进展，并总结了近年来药动学研究的难点，为相关研究提供了理论和技术基础。

1 多肽类药物的几种常见给药方式及吸收途径

多肽相对分子质量较大，多采用静脉注射（iv）、腹腔注射（ip）、皮下注射（sc）等方式给药，少数也可通过鼻腔和肺内给药。

1.1 静脉注射

药物进入静脉后，经上腔静脉和下腔静脉稀释流入心脏，经肺动脉泵入肺，药物通过体循环运输至全身各组织器官，进而抵达治疗靶点。以iv方式递送的药物生物利用度接近100%，且可避免肝的“首过效应”［8］，是一种较为理想的给药方式。一般iv给药后，药物分布广泛且消除迅速，目前已尝试开发不同的给药体系来应对生物半衰期短的挑战。如将多肽与聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球［9］或多囊脂质体［10］等载体缀合，载体通过不同的机制释放药物，从而保护肽免于快速降解，延长其在体内驻留时间。

1.2 皮下注射

iv给药时，肽在注射部位几乎无药物损失，但在其他给药途径中，一般需要穿过生物屏障（如上皮或黏膜层）才能进入循环系统。由于sc吸收较慢，比iv更为安全，成为递送多肽最常用的方式之一。局部血流量、注射深度和体积、皮下组织中肽的降解以及肽的相对分子质量等都可影响其吸收［11］。Vugmeyster等［12］提出，多肽从皮下组织吸收到循环系统的机制可能是物种依赖性的，其皮下吸收机制及药动学参数在啮齿类与非啮齿类动物可能存在一定差异。由于特定蛋白多肽类药物的皮下吸收机制和途径以及各种因素对吸收率的影响仍各不相同，其是否可采用sc方式尚需进行针对性研究。

1.3 腹腔注射

腹膜表面有丰富的静脉丛，多肽类药物经ip给药后，游离在腹腔中的药物跨静脉血管上皮细胞后，一部分进入门静脉，再流入肝，经肝代谢酶代谢后向全身组织分布；另一部分流入腹主静脉后进入体循环［8］。由于腹膜面积较大，药物吸收速度较快，使ip成为常用的给药方式之一，适用于小鼠等静脉细小和iv给药有难度的实验动物。

1.4 鼻腔或肺内给药

多肽可以药物气溶胶形式吸入鼻腔与呼吸道。鼻黏膜较薄，黏膜上皮组织覆盖一层微绒毛，极大增加了吸收面积，而且鼻黏膜血管丰富，药物穿过毛细血管壁进入体循环，可避免肝的“首过效应”。深呼吸时，药物气溶胶可以沉积在肺泡表面，由于肺泡表面积大，肺泡壁极薄，多肽能快速吸收且生物利用度比经口（po）和灌胃（ig）高 10～200倍［13］。肺内途径给药经常因病理性鼻腔疾病（如鼻炎和感冒等）而引起较大的个体间吸收差异［14］。Dhuria等［15］提出，大分子可直接从鼻腔吸收并能穿透血脑屏障入脑。但由于递送效率较低，针对鼻腔和肺内给药方式常配合施用渗透增强剂，以增强药物穿透鼻腔黏膜和呼吸道上皮层。目前已有胰岛素与细胞穿膜肽（cells penetrating peptide，CPP）共同施用的实例［16］。

1.5 经口给药

po摄入的肽在胃肠道消化，并以寡肽形式被吸收［17］。由于多肽的代谢稳定性和肠上皮渗透性较差，药物递送存在巨大挑战。Ning等［18］在啮齿动物急性毒性试验中对527种脂肪族和芳香族化合物的平均放射性残留量进行了比较，结果表明，iv是最敏感的毒性暴露途径，po则最不敏感，这也说明给药方式的差异导致药物的吸收率存在显著差异。提高多肽药物po给药途径的生物利用度已成为近年来相关领域的研究热点［19-20］。Kristensen 等［21］报道，多肽通过直接易位、细胞旁转运、内吞作用和载体或受体介导的运输等机制跨小肠上皮细胞膜进入小肠毛细血管或毛细淋巴管。近年来，众多研究提出，将CPP作为药物载体可以有效克服肠上皮细胞屏障，促进胃肠道吸收［16，22-26］。近年来，出现几种新型多肽药物递送策略，如po渗透促进剂（如CPP）、蛋白酶抑制剂、聚合物或黏膜粘附载体以及化学修饰等方式都能显著提高多肽药物的口服生物利用度［24］。Kristensen团队（26）评估了各种CPP与甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）的生物活性部分共价缀合的效果，发现同时施用等摩尔量的CPP与PTH能够介导PTH更有效地跨小肠上皮细胞转运。

2 多肽类药物在组织器官的吸收和分布

多肽类药物在体内代谢稳定性差，一般会产生首过效应，且表观分布容积小，其主要随血液循环分布到血浆、肺、肝、胰腺、肾和皮肤等组织器官中。

2.1 多肽类药物的转运与分布

多肽类药物的转运途径受其分子大小影响较大。相对分子质量较大的蛋白质等大分子可通过淋巴循环分布到靶组织或靶器官，淋巴循环也可使药物有效避免首过效应［8］。药物通过被动扩散从血液向淋巴液转运，故血药浓度一般高于淋巴液中的药物浓度［8］。相对分子质量<5000的小肽几乎全部由血管转运，而部分难以进入毛细血管的大分子多肽与小蛋白质（相对分子质量为5000～12 000）通过淋巴管被吸收［27］。淋巴管比毛细血管具有更高的渗透性，因此较大的分子更易穿透淋巴管壁。但Kagan等［28］发现，大鼠sc给予牛胰岛素1 U·kg-1后，几乎未进入淋巴系统，表明淋巴系统不是胰岛素的主要吸收途径。对于大多数相对分子质量为1000～10 000的肽，通过血液和淋巴系统组合吸收，最终被摄取到作为主要吸收途径的毛细血管中［29］。

由于肽类较高的氢键结合能力和较低的亲脂性，不易穿过生物膜，因此多数肽具有较低的膜渗透性，往往被限制在胞外空间［30-31］。扩散和对流都可参与肽的分布，二者相对占比取决于肽的大小和结构，限制肽跨上皮细胞渗透性的最重要的因素是氢键数量、亲水性和相对分子质量［30］。肽的跨细胞转运受其分子极性的限制，而细胞外的膜渗透还要受其分子大小的限制，当肽的相对分子质量＞1000时，其有效吸收则通常需要吸收促进剂。Kovalainen等［11］报道，肠上皮细胞的渗透仅限于相对分子质量≤3500的分子，鼻内途径可不借助吸收促进剂，允许吸收较大的肽（相对分子质量＞2000）。除分子大小之外，肽的构象也对其生物膜渗透能力有影响，环状肽的生物膜渗透性低于线性肽。药物总体组织分布程度一般通过稳态表观分布容积（Vdss）来反映［32］，多肽药物的Vdss通常较小，一般不大于细胞外体液的体积［30］。

2.2 血浆蛋白对多肽类药物吸收和分布的影响

药物进入血液后，会与血浆蛋白结合，使药物分子变大，阻碍其转运与分布。药物的血浆蛋白结合率（binding rate of plasma protein，BRPP）是药动学的重要参数之一。当药物-血浆蛋白结合率较高时，意味着能自由向体内各组织器官转运的游离药物大大减少，对药物的组织分布有极大影响，且内源性蛋白的存在往往对多肽药物定量分析造成干扰。

人血清白蛋白（human serum album in，HSA）与多肽的结合能力强，生理浓度高，是心血管系统最丰富的转运蛋白，可作为内源化合物或外源性药物的载体［33］。多肽药物与HSA的结合可能是延长药物体内循环时间的普遍机制［34］。如重组醋酸艾塞那肽（exendin-4）的半衰期为 0.48 h［35］，但与HSA结合后，其半衰期可达8 d［20］。GLP-1白蛋白融合蛋白阿必鲁肽（albiglutide）将GLP-1的半衰期延长了约3600倍［33］。研究人员已采取相应方法应对血浆蛋白的影响，Li等［36］使用咪唑 80 mmo l·L-1有效地清除了大部分非特异性血浆蛋白，而不影响endostar的保留，使用Tris-HCl缓冲液中的咪唑能够洗脱非特异性血浆蛋白。

2.3 多肽药物的免疫原性

自20世纪90年代以来，由于肽的易生产、低成本等特点，基于肽的疫苗已被广泛用于针对病毒、细菌和癌症的免疫反应。Cárdenas-Vargas等［37］证实，接种三价灭活流感疫苗（trivalent influenza inactivated vaccine，TIV）后会诱导一定量的特异性IgG1，IgG2a和IgA抗体，并能刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞增多，引起免疫应答反应。多肽类药物结构及理化性质多样，杂质成分难以确定，且多肽生物制剂不是自身抗原，具有潜在的免疫原性。当药物摄入后可刺激机体产生抗药抗体（anti-drug antibodies，ADA），中和药物，促进免疫复合物被免疫系统清除而降低药效［38］。对于单克隆抗体类药物，其免疫原性可能受很多因素影响，其中“同源性”是最重要的因素。一般认为，与人同源性越高的单抗分子，产生ADA的风险越低，反之则越高［32］。ADA的形成可改变药效和药物吸收、分布、代谢和排泄过程，导致药物清除率增加，生物活性发生改变，也会使药动学特征呈非线性［39］。

3 肽类药物的消除机制

多肽在体循环中的清除主要是通过酶促水解和肾小球滤过［40］。此外多肽还存在内吞消除和靶点介导消除等机制。

3.1 多肽药物的酶解消除

不同于小分子药物，多肽药物主要通过肽酶水解，产生的氨基酸及小肽大多会进入内源氨基酸库，用于内源性物质的合成，多肽药物很少以原形药排泄［41］。体内存在＞550种蛋白酶［42］，它们分布于各组织器官内，包括肠道分泌的蛋白酶（如胃蛋白酶，弹性蛋白酶，胰蛋白酶和糜蛋白酶）和刷状缘膜结合酶（如内肽酶，氨肽酶和羧肽酶）等［43］。由于肽酶的分布广泛，多肽药物在人体内往往消除半衰期（t1/2）较短，如：胰岛素t1/2＜9 m in，血管紧张素t1/2<1 m in［31］，exendin-4 在肾和肝匀浆中 t1/2分别为7.8m in 和 100.9m in［44］。

蛋白酶对多肽的水解往往具有一定的特异性，即选择性地作用于某些特定的氨基酸位点。肽酶可分为外肽酶和内肽酶，它们具有不同的作用机制。肽和蛋白质的水解通常起始于内肽酶，它作用于蛋白质的中间部分，酶解产生的短肽可进一步被外肽酶降解［43］。而外肽酶则从肽的N或C端切割氨基酸［31，40］。Yamamoto 等［45］在文献中提到，能被酶水解的最短肽是三肽，蛋白质经历多步骤的酶水解产生的最终代谢产物——氨基酸和二肽进入体内氨基酸库被重新利用，用于合成机体维持生理功能所需的结构性和功能性蛋白质。某些肽类药物的代谢产物还可能会具有一定的生物功能，如Sharm a等［44］在研究GLP-1代谢时发现，其代谢产物对葡萄糖异生和胰岛素氧化应激具有一定作用。各组织器官所分布的肽酶种类不同、药物的吸收途径有差异，所以对药物消除的速率和程度也有影响。

了解多肽药物的酶切位点能指导对肽的结构进行合理的修饰，使其被蛋白酶降解达到最小化。在新药开发中，肽的水解酶和特异性酶切位点通常都是未知的，酶切位点可用软件预测，目前常用的软件有NebCutter，PROSPER，CutDB和Seqbuilder等。多肽药物可通过体外实验评估其代谢稳定性，筛选酶切位点和代谢产物并确定药动学信息。如将肽类药物温育在生物基质中（人工胃液、肠液、血清、肝或肾组织匀浆等），使用液质联用技术（LC-MS/MS）定量原型药物并监测其降解程度，评估代谢稳定性，筛选代谢产物［40，44，46］。

3.2 多肽药物的内吞消除

多肽是水溶性分子，相对分子质量较大，一般难以扩散通过细胞膜。部分小肽分子具有足够的疏水性，能以自由扩散跨过细胞膜；对于疏水性较强的大分子多肽则可通过易化扩散进入细胞；多数水溶性肽可通过内吞方式跨膜［11］。具有较高相对分子质量的肽（如胰岛素等）在被内吞后会在溶酶体降解。肽类跨膜转运受其分子大小和亲水性的严重限制。相对分子质量＜500的小肽可通过內吞途径穿膜进入细胞，而后首先被定位在内体中，再通过内体-溶酶体途径消除［47］。

CPP是一类能携带大分子穿膜进入细胞的短肽（＜30个氨基酸），最初报道于20世纪90年代，近年已成为药物靶向递送和基础研究的热点［48］。CPP通常富含碱性氨基酸（Arg或Lys）残基，这使其能与带负电的细胞表面分子发生静电相互作用，促进大分子蛋白质内吞进入细胞，其相对于传统小分子药物靶向性更强，不引起机体免疫应答［22］。有文献指出，CPP可通过网格蛋白介导的内吞、小窝介导的内吞或巨胞饮作用等机制摄入细胞［47］。目前CPP的具体入胞机制仍不明确，但最近Kristensen等［21］和Walrant等［24］提出，氨基酸与糖胺聚糖的静电相互作用是其摄入的最关键步骤。由于CPP穿透细胞缺乏特异性，给药后会增加药物分布容积和暴露量，增加了毒副作用的风险。提高CPP转运的靶向性将是今后相关研究的重点方向。

多肽药物还可通过靶点介导消除（targetmediated clearance，TMC）方式消除，如单抗类药物，抗原介导的特异性消除则是最重要的方式［31］。某些多肽由于相对分子质量大，具有较低的肾清除率，则与新生儿Fc受体（neonatalFc receptor，FcRn）结合，减少了通过血管上皮细胞的胞饮作用实现的内吞，因而以TMC机制消除。靶点介导的内吞作用最终也由溶酶体降解。受体介导的肽摄取是肽消除的特定特征，即使在治疗浓度下其药物分布往往也会存在靶点的饱和而导致药代动学特征呈现非线性［49-50］。多肽常见的一种蛋白质靶标是GLP-1受体，药物与靶细胞GPCR结合后引起细胞应答，但当药物浓度过高而使受体饱和，药物会发生非线性消除。

3.3 多肽药物的排泄

药物最重要的代谢器官是肾和肝，主要通过尿液和粪便途径排泄。一般认为，多肽主要经肾小球滤过，随尿液排出。

3.3.1 多肽药物的肾消除

经肾小球滤过的小分子多肽进入肾小管，管腔内刷状边缘膜中的肽链端解酶将其水解成氨基酸，再被重新吸收到氨基酸循环。有些多肽先断裂成小肽，再转运至近曲小管上皮细胞内水解［42］。肽一般不易通过肾小管重吸收［39］，游离在血液中的小肽，即使未被完全水解，也会经肾小球滤过而进入尿液被排泄。多肽药只有当酶降解途径被阻断时，肾清除才是显著的消除途径［30］。肾小球的孔径为6～10 nm，一般小于白蛋白分子质量（相对分子质量约68 000）的亲水性分子能滤过肾小球。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化修饰是多肽药物改造的常用方法，PEG化的多肽能保护肽活性位点不被降解，增加的分子质量也限制了肾排泄过程［40，45-46，51］。Li等［52］测得125I标记的重组人内皮抑制素M 2ES在尿液中回收的放射性为摄入药物的71.3%，说明其主要排泄途径是尿液。对于某些肾功能不全患者，要适当调整给药剂量，避免药物过多的暴露量，导致毒性的积累而对机体造成损伤［53］。

本课题组从东北林蛙皮中发现并优化的抗菌肽AWRK6具有促胰岛素分泌、中和LPS内毒素等功效。利用显微成像技术发现，AWRK6并不能通过内吞进入MIN6胰岛细胞［54］。AWRK6结合GLP-1受体后引起细胞应答，推测其脱离靶点后经过多次酶解反应，主要通过肾小球滤过消除，后续的AWRK6药动学研究正在进行之中。

3.3.2 多肽类药物的肝消除

肝在肽类药物代谢中发挥着十分重要的作用。如Heather等发现t1/2为110m in的GLP-1（9-36）酰胺在肝细胞中可迅速降解［47］。对大多数肽而言，肝代谢比小分子药物重要得多，一些小肽如环孢素和波替单抗（硼替佐米，bortezomab）在肝中几乎完全降解［55］。多肽药物进入肝细胞后则被内质网上的肝微粒体酶系（主要是细胞色素P450酶）降解。代谢物分泌到胆汁中进入肝肠循环，在肠腔继续降解。

3.3.3 多肽药物的胃肠道代谢

多肽类药物通过po给药生物利用度极低，主要由于胃肠道内存在大量肽酶，主要包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、弹性酶、羧肽酶A和B、黏膜细胞酶及刷状缘胞液酶（氨基三肽酶、脯氨酰肽酶、肌肽酶和二肽酶）等，其中胰蛋白酶是胃肠道最主要的蛋白酶［42］。除了少数多肽外，药物极少以药物原型形式排泄［40］。而且绝大多数肽类药物的粪便回收率很低。Li等［52］对125I标记的M 2ES进行药动学研究中，给药后24 h胆汁中仅有0.98%的放射性排泄，给药后432 h粪便中回收的放射性为8.3%。但近些年也有研究人员提出新方法提高多肽药物在胃肠道的稳定性。Koide等［17］设计的多肽具有稳定的三螺旋结构，在胃肠道中较稳定，粪便中的药物回收率可达13%～72.3%，可作为多肽药物的新型支架。

4 展望

多肽药物是近年来研究的热点之一，随着研究与开发的不断深入，该类药物药动学研究也面临众多挑战①体内肽酶种类多样、酶解位点多，代谢机制可能有交叉，因而难以确定多肽在体内的主要代谢产物及活性与非活性形式。②多肽类药物代谢稳定性差，生物半衰期较短，药物结构面临不断优化改造的问题。③该类药物可与体内的受体、抗原和血浆蛋白等结合，难以区分游离药物、代谢物及结合药物。④肽类药的给药量极低，一般都在μg和ng水平，体内药物含量低，对药物检测的灵敏度要求较高。因此，在多肽药物的药动学实验设计中，要充分考虑药物代谢特点的种属差异，选择合适的模型动物，实验动物要接近人体对药物的ADME特点；依据药效学与毒理学实验数据，确定科学的给药剂量与测量时间点；分析药物代谢是否存在非线性消除，建立针对性强的药动学模型，选择多种特异性强、灵敏度高的药物检测方法相互验证补充。

尽管一般适用于小分子的药动学原理同样适用于多肽类药物，但由于多肽药物具有分子量大、易降解和渗透性差等特点，且存在内源蛋白的干扰，在药物开发过程中必须考虑药动学特点对分析方法选择的限制。针对天然多肽药的药动学分析方法已有大量文献报道，一些常规方法（如免疫分析法等）并不能对合成与改造的多肽进行精确的定量分析，需要采用同位素标记、液质联用和活体成像等方法，且考虑体内实验与体外实验相结合进行研究。