幼龄家兔肌内注射金属汞的局部及全身毒性作用

石笑晴，吴虹林，何玺玉，

（1.安徽医科大学解放军307医院临床学院，安徽合肥 230032；2.解放军第307医院儿科，北京 100071）

金属汞（Hg）是自然界中唯一在常温下呈液态的重金属，具有密度大、流动性强和易挥发的特性，在生产和生活中应用广泛，同时对人体可造成不同程度的损害。汞中毒常见的途径有呼吸道吸入、皮肤接触和消化道吸收，亦可经皮下、静脉和肌内注射吸收。短期、大量或长期Hg暴露后可对呼吸系统、消化系统、神经系统和泌尿系统产生不同程度损害，具体损害程度与Hg暴露途径和剂量相关［1］。

体内注射Hg多以自杀或故意伤害为目的，也可由迷信所致。皮下、皮内或肌内注射Hg后，多在局部发生毒性炎症反应，也可累及其他脏器引起全身中毒症状，大剂量静脉注射Hg则可能发生肺栓塞及心、脑、肝或肾的严重损害而导致死亡［2-9］。近年来，国内外Hg经皮下、肌内和静脉注射进入儿童体内致汞中毒的案例报道逐渐增多［10-14］，国内也有大剂量注射Hg致儿童汞中毒的报道［15］，但对于儿童外源性Hg暴露后的毒性作用研究较少。由于儿童处于生长发育阶段，汞中毒后局部及全身的毒理作用机制尚不明了，而且现今儿童Hg中毒后的干预方式也多仿照成人的经验采用螯合剂及手术治疗。临床治疗干预过程中发现，过早进行外科手术可能会导致Hg再次扩散和吸收入血，使中毒加重，并需要多次手术治疗。因此，需改进选择手术治疗的方式及时机。本研究以幼龄新西兰兔为研究对象，建立im给予汞中毒幼兔模型，探讨注射Hg后的中毒表现、对神经系统的影响、局部病理包裹形成的时间及在包裹形成前后血汞和尿汞水平的变化，为探讨手术取Hg和螯合剂驱Hg联合治疗提供实验借鉴，同时也为儿童汞中毒神经系统损伤评价和随访提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Hg（国药集团化学试剂有限公司，每瓶250 g），神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）试剂盒和星形胶质源性蛋白（S100B）试剂盒（武汉云克隆动物有限公司），2%戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司），4%多聚甲醛（西陇化工股份有限公司）。X线透视机（普朗PLD5100B，南京普朗医疗设备有限公司），光学显微镜（ECLIPSE E200，日本株式会社尼康），全自动酶标仪（MK3，美国Thermo公司），电子分析天平（ME235S，德国Sartorius公司），低温离心机（3K-15，美国Sigma公司），Agilent ICP-MS（7700x，美国Agilent公司）。

1.2 实验动物和分组

雄性40日龄新西兰兔20只，体质量1000～1300 g〔北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号：SCXK（京）2015-0005〕，适应性饲养1周，实验期间自由摄食（收取尿样时禁食）、饮水。将幼兔随机分为4组（n=5），分别为正常对照（0.9%生理盐水0.1 m L·kg-1）及Hg 700，1400和2800 mg·kg-1组。

染毒方法仿照临床病例的暴露途径，臀部一次性im Hg染毒。查阅国内外关于注射Hg的文献及解放军307医院儿科所接诊的注射Hg中毒的病例，筛选出有注射Hg剂量、有局部病理反应和全身中毒症状的5例病例资料，除以相应体质量（按实测体质量或不同年龄段体质量换算公式计算）后所得数据分别为32，604，1360，1440和1600mg·kg-1，取中位数为中剂量组，约为1400 mg·kg-1，按毒性实验设计中剂量倍数关系将700 mg·kg-1设为低剂量组，2800 mg·kg-1设为高剂量组。

1.3 一般状况和体质量变化

每日1次临床观察，记录外观体征（包括进食状态、毛发色泽、双耳皮温和颜色、精神状态和尿便性状）、注射部位变化（包括有无红肿、结节、溃疡或脓肿形成）和汞中毒反应（包括有无分泌物增多、步态不稳、行动障碍、痉挛或易激惹）。分别在染毒当天（染毒后第0天）和染毒后7，14，21，28和35 d测体质量。

1.4 注射局部X线检查

分别在染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d拍摄局部注射部位X线片，观察Hg在局部的扩散。将所有幼兔取至X线摄片室，ip给予2%戊巴比妥钠40 m g·kg-1（2 m L·kg-1），先给前2/3药量，观察麻醉效果；麻醉后将其固定，保持侧卧位，拍摄局部注射部位X线片。待X线片提示Hg的形态无明显变化时，终止实验。

1.5 电感耦合等离子体质谱法检测血汞和尿汞水平

分别于染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d耳缘静脉采全血约2 m L置于EDTA K2抗凝管中，轻轻摇匀，配平后放入低温离心机，1610×g离心10 m in后取上清液，用电感耦合等离子体质谱法测定血浆中的汞含量；于相同时间节点采集兔尿液，尿液采集前12 h禁食，给与足够的饮用水，麻醉后仰卧位固定，充分暴露外阴，碘伏消毒外生殖器，将涂有石蜡油的导尿管从家兔的尿道插入，而后向下缓慢推进，插入6～7 cm即可进入膀胱，留取1.5 m L尿液，用电感耦合等离子体质谱法测定尿液中的汞含量。

1.6 ELISA法测定NSE和S100B浓度

分别于染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d耳缘静脉采全血约2 m L，置于离心管中，静置1 h，配平后放入低温离心机，1610×g，离心10m in后取上清液，采用双抗体夹心ELISA法测定NSE和S100B浓度。

1.7 HE染色观察注射部位病理变化

待Hg在局部无明显扩散后处死全部幼兔，留取局部注射部位组织，4%多聚甲醛固定，流水冲洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋，涂片、切片、烤片，HE染色，染色后脱水、透明、封片。光学显微镜下观察局部病理变化。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 幼兔肌内注射Hg一般状况观察

正常对照组幼兔一般状态良好，进食、毛发、双耳皮温和颜色、精神状态和尿便性状均未见明显异常，局部注射部位未见红肿、结节、溃疡或脓肿形成，未见分泌物增多、步态不稳、行动障碍、痉挛或易激惹等症状；Hg 700mg·kg-1组在染毒后14 d开始出现轻度腹泻、进食减少和反应差；1400m g·kg-1组在染毒后10 d开始出现轻度腹泻、进食减少和反应差，1只兔在给药后第4周出现严重的皮肤黏膜苍白；2800 mg·kg-1组在染毒后7 d开始出现轻度腹泻、进食减少和反应差。所有实验组幼兔在染毒后21 d开始陆续出现易激惹和分泌物增多，未见步态不稳、行动障碍及痉挛等表现，部分在染毒后21～28 d在局部注射部位可见结节和脓肿形成，未见溃疡，少数伴有皮温升高和波动感。染毒组幼兔尿液性状、毛发和四肢均未见异常。

2.2 幼兔肌内注射Hg对体质量的影响

所有幼兔在受试期间体质量均持续增长，但增长的幅度各不相同。正常对照组体质量增长最多，Hg 700和1400 mg·kg-1组体质量增长较少，2800 mg·kg-1组体质量增长最少，且自染毒后21 d起2800mg·kg-1组体质量明显低于对照组（P<0.05），但700和1400 mg·kg-1组体质量与正常对照组相比无统计学差异，3个剂量组之间亦无统计学差异（图1）。

2.3 幼兔肌内注射Hg注射部位局部X线表现

在局部注射部位X线片上可见大量形态不规则的高密度影，染毒剂量越大，高密度影的强度和面积越大。观察不同时间Hg在局部的扩散发现，在im Hg后的前28 d，Hg扩散速度较快（图2：0 d→7 d→14 d→21 d→28 d），且扩散形态较规整；染毒后35 d局部X线扩散形态与染毒后28 d相比无明显变化（图2：28 d→35 d）；提示在im Hg后约28 d局部病理包裹可能已形成。

Fig.1 Effect of intram uscular in jection m etallic m ercury（Hg）on body m ass in young rabbits.Young rabbits were treated with Hg 700，1400 and 2800 m g·kg-1 at 0 d and the body m ass was recorded at 7，14，21，28 and 35 d a fter Hg exposure，respectively.x±s，n=5.＊P<0.05，compared with norm al contro lgroup.

2.4 幼兔肌内注射Hg后血汞和尿汞水平

与正常对照组相比，Hg 700，1400和2800mg·kg-1组血汞和尿汞水平在染毒后7，14，21，28和35 d明显升高（P<0.01），且染毒剂量越大，血汞和尿汞浓度越高。但染毒后35 d血汞和尿汞升高的速度较前28 d减慢。与正常对照组相比，在染毒后7，14，21，28和35 d，Hg 700mg·kg-1组血汞升高倍数分别为64.2，95.2，189.5，215.6和194.0倍，1400mg·kg-1组血汞升高倍数分别为189.6，191.0，343.4，345.2和330.9倍，2800 mg·kg-1组血汞升高倍数分别为237.3，394.9，590.6，634.8和588.2倍；700 mg·kg-1组尿汞升高倍数分别为31.6，70.1，138.7，248.6和272.8倍，1400 mg·kg-1组尿汞升高倍数分别为60.4，99.4，258.2，354.7和400.0倍，2800mg·kg-1组血汞升高倍数分别为74.8，161.8，553.3，1100.0和1095.2倍。Hg 700，1400和2800 mg·kg-1组血汞和尿汞水平自染毒后7 d起每两组间均有明显统计学差异（P<0.01，图3）。

Fig.2 X-ray performance of local in jection site after in tram uscu lar in jec tion of Hg in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.Red arrows show the Hg in jected into the m uscle.

Fig.3 Effect of intram uscular injection of Hg on m ercury level in b lood and u rine in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=5.＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.5 幼兔肌内注射Hg对血清NSE和S100B水平的影响

与正常对照组相比，Hg 700和1400 mg·kg-1组血清NSE在染毒后28 d开始持续升高（P<0.05），2800 mg·kg-1组在染毒后21 d开始明显升高（P<0.05），Hg 700，1400和2800 mg·kg-1染毒组组间无统计学差异（图4）。

与正常对照组相比，Hg 700，1400和2800mg·kg-1组血清S100B分别在染毒后28，21和14 d开始显著升高（P<0.01），2800 mg·kg-1组血清S100B在染毒后14 d开始显著高于700和1400 mg·kg-1组（P<0.01，P<0.05），1400 mg·kg-1组血清S100B在染毒后21 d开始显著高于700 mg·kg-1组（P<0.01）（图5）。

Fig.4 Effect of intramuscu lar injection of Hg on serum neu ron-specific eno lase（NSE）in young rabbits.See Fig.1 for the treatm ent.，n=5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，com pared with norm alcontrolgroup.

Fig.5 Effect of intram uscu lar in jection of Hg on serum S100B in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.，n=5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group;##P<0.01，compared with 700mg·kg-1 group;△P<0.05，compared with 1400 mg·kg-1 group.

2.6 幼兔肌内注射Hg局部注射部位解剖和病理组织学改变

部分幼兔在染毒后约21 d，局部注射部位可触及硬节和脓肿形成；染毒后35 d，Hg 700，1400和2800 mg·kg-1组局部注射部位解剖可见脓性包裹形成，包膜完整，切开后可见大量脓性物质和多发散在的银白色Hg滴（图6）。组织学观察可见大量含有Hg滴的微小脓肿，Hg滴周围可见大量中性粒细胞、巨噬细胞和少量泡沫细胞浸润，部分小血管增生、充血及出血。部分区域坏死伴肉芽组织形成（图7）。

Fig.6 Anatom ical changes in local injection site of intramuscular injection of Hg in young rabbits.Young rabbits were treated with Hg 700（A），1400（B）and 2800 mg·kg-1（C）at 0 d and the tissue of local injection site was taken at 35 d after Hg exposure.Red arrows show large complete abscesse and numerous，tiny，glistening droplets ofmetallic mercury.Left：complete pathological inclusion body;Right：large am ountof unoxidiced Hg droplets.

Fig.7 Histo logical changes in local in jection site of intramuscu lar in jection of Hg in young rabbits by HE staining.See Fig.6 for the treatment.Red arrows in A（ Hg 700 m g·kg-1）and B （1400 m g·kg-1）show clusters ofm icroabscesses containing m ultip le scattered mercury d rop lets surrounded with num erous neutrophils，macrophages and a few m ultinucleate foreign body giant cells.Hyperp lasia，hyperem ia and hem orrhage in sma ll vessels a lso could be seen in this area.Red arrows in C（Hg 2800 m g·kg-1）show granulom atous response.

3 讨论

本研究发现，Hg经im进入机体后引起的病理变化与其他途径染毒存在差异，绝大部分在局部产生急性炎症反应，出现非特异炎性病理改变和组织包裹的结局。部分汞经细胞摄取进入血液，进而随血液循环运送至脑、肺、肝、肾和肠道等器官，与含有巯基的蛋白质或酶形成络合物沉积在体内，引起腹泻、进食减少、反应差、易激惹、分泌物增多及贫血等相关表现，与国内外的研究结果相近［16-17］。但幼龄动物的发育特性表明，汞中毒后中枢神经系统损伤更加明显、发生时间更早。汞透过血脑屏障入脑后，主要沉积在含有大量巯基、氨基和羧基的脑干神经核团的大、中型细胞质和小脑浦肯野细胞层中，通过脂质过氧化损伤激活星形胶质细胞、升高细胞内游离钙离子浓度、耗竭乙酰胆碱、升高轴突间隙中兴奋性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）水平和促进一氧化氮合成发挥神经毒性作用［18］。有研究表明，儿童期Hg暴露可能导致神经发育性疾病，如自闭症、焦虑和抑郁等［19］，长期低水平的Hg暴露还可引起广泛的学习记忆障碍［20］。NSE特异性存在于神经元胞质中，当神经元细胞膜功能与结构受损时，可大量释放至脑脊液和血液中，是颅脑损伤和神经元功能损伤的重要指标［21］。星形胶质源性蛋白S100B主要存在于哺乳动物的星形胶质细胞中，在调节神经细胞的能量代谢、维持细胞内环境稳定和细胞形态中有着重要作用［22］。当胶质细胞损伤时，可释放大量S100B到脑脊液和血液中，且血清含量与脑脊液含量有良好相关性，可用于评判血脑屏障和胶质细胞的损伤程度［23］。同时NSE和S100B也在体外研究中用于评估无机汞的神经毒性［24］，在儿童汞中毒CNS损伤的血清学变化研究中也有S100B和NSE升高的报道［25］。本研究通过对血清NSE和S100B浓度的检测发现，NSE在汞中毒出现神经系统症状后开始明显升高，升高的程度与中毒剂量关系不甚密切；血清S100B在汞中毒出现神经系统症状前就已明显升高，且有中毒剂量依赖性，中毒剂量越大，血清S100B浓度越高。进而表明S1001B能用于更好地评价汞中毒后中枢神经系统损伤的程度，从而为远期随访提供可参考的依据。

Hg经im进入机体后远处扩散的能力也是有限的，约4周可在局部形成异物组织包裹。大体可见结节和脓肿形成，解剖学可见完整的病理包裹，组织学HE染色可见多发含Hg滴的微小脓肿，围绕汞滴可见大量中性粒细胞、多核巨噬细胞和少量的异物巨细胞，同时还可见到肉芽组织形成，符合无菌性炎症反应的改变。在病理包裹形成后，血汞浓度升高的速度也随之减慢。该发现提示，在治疗大剂量注射汞中毒时，在不危及生命的情况下，可先试行螯合剂驱Hg治疗。如组织包裹形成之前过早手术治疗不仅切除不彻底，而且会导致Hg的进一步扩散进而影响治疗效果。应待病理包裹形成后再行外科手术治疗为宜，从而能较彻底清除体内的Hg，减少多次手术的机会和术中二次吸收的可能。

因此，Hg经皮进入皮下及肌肉暴露后，不仅造成局部的病理变化，而且会播散至全身造成多器官受累。通过X片观察Hg在局部扩散的变化，发现在注射金属后约4周可形成局部异物包裹，这为临床手术治疗的时机提供参考。幼龄动物汞中毒后中枢神经系统的损伤尤为突出，表现为神经细胞功能的生化标志物异常，这为儿童汞中毒神经系统损伤评价和随访提供参考，同时也为进一步研究采用手术取Hg及螯合剂驱Hg联合治疗的时机及疗程提供理论指导及实践依据。