基于高内涵分析方法建立稳定共表达人δ阿片受体与PKAcat-EGFP的CHO细胞模型

李玉蕾 ，颜 慧 ，王莉莉 ，宫泽辉 ，苏瑞斌

（1.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，2.抗毒药物与毒理学国家重点实验室，3.神经精神药理学北京市重点实验室，北京 100850）

研究表明，δ阿片受体（delta opioid receptor，DOR）的激活可减轻慢性疼痛及负性情绪状态（如抑郁），且DOR在神经保护、药物滥用和冲动控制障碍等方面的作用也有相关研究报道［1］，是新药研发的重要靶标。因此，建立高效筛选靶向DOR配体稳定转染细胞模型的重要性不言而喻。

以往建立的DOR单基因转染细胞株阳性克隆的筛选方法，无论是RT-PCR和Western蛋白印迹法，还是放射性配体受体结合实验等，都存在细胞用量大、过程繁琐和实验周期长的缺陷，常会延迟阴性克隆的去除，且筛选出的阳性克隆还需再进行功能分析，投入的资金与精力较多［2-3］。

高内涵分析（high-contentanalysis，HCA）是通过对荧光标记物的分析，检测生物刺激或药物处理导致多种细胞反应的技术，目前已成为一个成熟的工具。通过HCA揭示的化合物对细胞的影响与化合物特异性有助于在药物研发的早期得出明确的结论，有望大大提高药物研发的效率［4-5］。

本研究利用HCA方法建立了人DOR（human DOR，hDOR）与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记的蛋白激酶A催化亚基（catalytic domain of cAMP-dependent protein kinase A，PKAcat）融合蛋白（PKAcat-EGFP）稳定共表达细胞模型，并利用特异性DOR激动剂SNC80对其功能进行初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

稳定表达PKAcat-EGFP的CHO细胞模型（CHO-PKAcat-EGFP）、pcDNA3.1/Hygro（+）质粒、Bam H I、Eco R V限制性内切酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、潮霉素B（hygromycin B，Hygro）、Lipofectam ine 2000、Hoechst33342 和 Hank′s平衡盐溶液（Hank′s balanced saltsolution，HBSS）（美国Thermo Fisher Scientific公司）；pcDNA3.1（+）-hDOR质粒（美国UMR cDNA资源中心）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞（北京天根生物技术公司）；去内毒素质粒提取试剂盒（美国OMEGA公司）；F12培养基（美国Hyclone公司）；G418（美国Am resco公司）；SNC80、佛司可林（forskolin）和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）（美国 Sigma Aldrich 公司）；96孔黑色透底检测板（美国Corning公司）；LANCE cAMP 384试剂盒和OptiPlate-384孔板（美国Perkin Elm er公司）；EVOSf1荧光倒置显微镜（美国AMG公司）；EnVision 2104多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）；In Cell Analyzer 1000高内涵细胞成像分析系统（美国GE Healthcare公司）。

1.2 p cDNA3.1/Hyg ro（+）-hDOR重组质粒构建

用Bam H I和Eco R V限制性内切酶对pcDNA3.1（+）-hDOR质粒和载体分别进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收hDOR与pcDNA3.1/Hygro（+）载体片段。将二者通过摩尔比（1∶1）连接过夜。连接产物转化DH5α新鲜感受态细胞，用含氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基平板筛选得到1～3号阳性菌落，分别接种于5m L含氨苄青霉素的液体LB培养基中扩大培养。各克隆取部分菌液提取质粒后，用Bam H I和Eco R V双酶切消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，同时取部分菌液测序、比对，选择序列比对结果正确的阳性克隆进行后续实验。

1.3 重组质粒转染至CHO-PKAcat-EGFP细胞

将细胞接种至6孔细胞培养板，第2天将pcDA3.1/Hygro（+）和pcDNA3.1/Hygro（+）-hDOR质粒利用Lipofectam ine 2000转染试剂分别转染至细胞中。第3天传代至75 cm2培养瓶中，第4天将含10%FBS的F12培养基更换成含Hygro 200 mg·L-1、G418 500 mg·L-1和10%FBS的F12培养基，每2 d换液1次。

1.4 有限稀释法克隆化培养转染细胞

培养12 d后消化细胞，混匀后将细胞密度稀释至5000 L-1，接种于96孔细胞培养板，每孔200 μL。6 d后镜下观察并标记只含1个细胞克隆的孔，继续培养至8 d后消化细胞克隆，取部分细胞接种至96孔黑色透底检测板中，每个克隆3孔，准备进行鉴定。

1.5 PKA重分布实验鉴定阳性克隆

每个克隆分为正常对照组、佛司可林组和SNC80组。细胞接种第2天，每孔加入100μL的F12培养基洗涤细胞1次，正常对照组和佛司可林组加入150μL F12培养基，SNC80组加入同体积含4 μm ol·L-1SNC80的F12培养基（SNC80终浓度1 μmol·L-1），细胞培养箱中孵育30 m in；孵育期间配制含40μmol·L-1佛司可林的F12培养基，各加50μL于佛司可林组和SNC80组（佛司可林终浓度10 μmol·L-1），正常对照组加50 μLF12培养基，细胞培养箱中孵育5 m in；孵育结束后，每孔加入100μL 12%甲醛溶液固定20 m in，200μL PBS洗涤细胞3次，100 μLHochest33342 1 μmol·L-1染核。用In CellAnalyzer1000高内涵细胞成像分析系统获取细胞荧光图像，多靶点分析模块（multitargetanalysis，MTA）分析PKAcat-EGFP的重分布程度，计算颗粒形成指数（fociformation index，FFI）。FFI=（颗粒荧光强度-背景荧光强度）×颗粒荧光总面积。实验结果以SNC80抑制forskolin引起cAMP增高的活性表示。活性（%）=（SNC80组FFI-佛司可林组FFI）/（正常对照组FFI-佛司可林组FFI）×100%。

1.6 SNC80诱导阳性克隆PKAcat-EGFP重分布

CHO-PKAcat-EGFP细胞与筛选出的CHOPKAcat-EGFP/hDOR-3克隆细胞分别接种于96孔黑色透底检测板，分为正常对照组、佛司可林组和SNC80组。实验过程同1.5。EVOSf1荧光倒置显微镜观察拍摄PKAcat-EGFP的重分布。

1.7 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞模型可靠性评价

接种细胞于96孔黑色透底检测板，分为正常对照组、佛司可林组和SNC80（100 nmol·L-1）组。实验过程同1.5。用In Cell Analyzer 1000高内涵细胞成像分析系统获取细胞荧光图像，MTA分析PKAcat-EGFP的重分布程度，计算各组FFI与Z′因子。Z′=1-（3σC++3σC-）/︱μC+-μC-︱。其中，σ 为标准差；μ为平均值；C+为阳性对照（SNC80组）；C-为阴性对照（佛司可林组）。

1.8 LANCE cAMP 384试剂盒考察CHO-PKA-cat-EGFP/hDOR-3细胞表达hDOR的稳定性

细胞接种至60mm细胞培养皿。第2天，用凡尔生（Versene）溶液消化细胞，HBSS吹打并重悬细胞，1000×g离心5 m in，细胞沉淀加适量刺激缓冲液（HBSS 含 HEPES 5 mmol·L-1，0.1%BSA，IBMX 0.5mmol·L-1）重悬并计数，调整细胞密度至1.2×109L-1。在Op tiPlate-384孔板中，分为正常对照组、佛司可林组和SNC80组。正常对照组每孔加入5μL刺激缓冲液，佛司可林组每孔加入2.5μL刺激缓冲液和2.5 μL 40 μmo l·L-1佛司可林（终浓度10 μmol·L-1），SNC80组每孔加入2.5 μL 4 μmol·L-1SNC80（终浓度 1 μmol·L-1）和 2.5 μL 40 μm ol·L-1佛司可林（终浓度10 μmol·L-1），各组每孔加入5 μL细胞-抗体复合物，混合后室温孵育30 m in，每孔加入10μL检测复合物，混合后室温孵育1 h。EnVision 2104多功能酶标仪测定665 nm发射波长的荧光强度。

1.9 用CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞模型评价药物活性

细胞接种于96孔黑色透底检测板，分为正常对照组、佛司可林组和不同浓度SNC80（0.01，0.02，0.05，0.14，0.41，1.23，3.70，11.11，33.33 和100.00 nmol·L-1）组，每组4复孔。实验过程与计算公式同1.5。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA3.1/Hyg ro（+）-hDOR的构建

琼脂糖凝胶电泳结果显示，1～3号阳性菌落在约1100 bp处均有目的条带（图1），证明hDOR基因片段已正确插入到重组质粒中并特异表达。其中1号阳性菌落测序结果与PubMed中hDOR DNA序列（No.NM_000911.3）比对完全一致，表明重组质粒已正确构建，可用于后续实验。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of pcDNA3.1/hygrom ycin B(Hygro)（+）-human delta opioid receptor（hDOR） recom binan t p lasm id digested with Bam H l and EcoR V.1-3：positive colony of pcDNA3.1/Hygro（+）-hDOR；M：DNAm arker.

2.2 筛选阳性克隆

克隆化培养挑选出53个单克隆，利用PKA重分布实验经过2次筛选，选出平均活性较高、细胞形态未发生明显变化且生长状态稳定的3号克隆细胞株（CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3）进行后续实验（图2）。

2.3 SNC80诱导CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞内PKAcat-EGFP重分布

如图3所示，在CHO-PKAcat-EGFP细胞和CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞中，单独给予佛司可林组细胞中荧光颗粒较相应正常对照组均显著减少。在CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞中，预先给予SNC80 1μmol·L-1组细胞荧光颗粒较佛司可林组显著增多，即PKAcat-EGFP发生了显著的重分布现象；而在CHO-PKAcat-EGFP细胞中，由于该细胞无hDOR表达，故对SNC80无反应，表现为SNC80组与佛司可林组细胞荧光颗粒无明显改变。

2.4 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞模型可靠性评价

Z′因子广泛应用于高通量筛选、HCA实验体系的稳定性和可靠性的评价之中，实验过程、仪器、化合物及其浓度均可影响Z′因子值，1≥Z′≥0。Z′=0，说明该实验体系不成立；0.5＞Z′＞0，说明该实验体系稳定性差；当1＞Z′≥0.5，说明实验体系稳定性好；当 Z′=1 时，则表示一种理想的实验体系［6］。SNC80 100 nmol·L-1作用时的Z′平均值为0.615（图4），证明该细胞模型稳定可靠。

2.5 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞表达hDOR稳定性评价

LANCE cAMP 384试剂盒是一种均相时间分辨荧光共振能量转移免疫分析。该测定基于铕（Eu）标记的cAMP示踪剂复合物与样品cAMP竞争AlexaFluor 647标记的cAMP特异性抗体上的结合位点。通过生物素-cAMP（b-cAMP）和铕-W 8044螯合物（Eu-SA）标记的链霉亲和素检测铕标记的cAMP示踪剂复合物。当抗体结合Eu-SA/b-cAMP示踪剂时，340 nm激发光激发示踪剂的Eu-SA分子，其发射的能量被转移到抗体上的Alexa分子上，产生665 nm的发射光。测试样品中cAMP的浓度与荧光强度成反比。如图5所示，以CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞冻存后再复苏的细胞作为第1代，经反复传代，用其第5代、第25代和第40代细胞进行稳定性评价，单独给予佛司可林10μmol·L-1组荧光强度较正常对照组明显降低（P<0.01），而同时给予佛司可林10 μmol·L-1和SNC80 1μmol·L-1组与佛司可林组比较，荧光强度显著增强（P<0.01）。表明细胞中的hDOR在40代以内能稳定表达，可满足实验需求。

Fig.2 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR c lone sc reening by PKA red istribu tion assay.Cells were treated with SNC80 1 μmol·L-1 for 30m in and forskolin 10 μmol·L-1 for 5 m in.A：the primary screening；B：the second screening.PKAcat：catalytic domain of cAMP-dependentprotein kinase A；EGFP:enhanced green fluorescentprotein.

Fig.3 PKAcat-EGFP redistribution in CHO-PKAcat-EGFP and CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone.Cells in forskolin group were treated with forskolin 10 μmol·L-1 for5m in.Cells in forskolin+SNC80 group were treated with SNC80 1 μmol·L-1 for30min and forskolin 10 μmol·L-1 for5m in.

Fig.4 Values of Z′facto r for evaluation and validation reliability of the CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone cell m odelby PKA red istribu tion assay.Cells were treated with SNC80 100 nmol·L-1 for 30m in.x±s，n=8.

Fig.5 Effects of forsko lin and SNC80 on cAMP concentration in CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone by LANCE cAMP 384 kit.Cells in forskolin group were treated with forskolin 10 μm ol·L-1 for 30 m in.Ce lls in forsko lin+SNC80 group were treated with SNC80 1 μmol·L-1 and forskolin 10 μmol·L-1 for 30m in.A-C：cell passage num ber 5，25 and 40.x±s，n=3.＊＊P<0.01，com pared with norm a l contro l group；##P<0.01，compared with forsko lin group.

2.6 用CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞模型评价药物活性

在PKA重分布实验中，阳性药SNC80（1×10-7～1×10-11mol·L-1）可浓度依赖性地激活CHO-PKA-cat-EGFP/hDOR-3细胞上的hDOR（图6），其EC50值为（6.192±1.225）×10-9mol·L-1，与文献报道基本一致［7］。

Fig.6 Concen tration-response cu rves of SNC80 in CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 cells by PKA redistribution assay.Cells were treated with SNC80 0.01，0.02，0.05，0.14，0.41，1.23，3.70，11.11，33.33 and 100.00 nm ol·L-1 for 30 m in and forskolin 10 μm ol·L-1 for 5 m in.x±s，n=3.

3 讨论

将外源基因导入真核细胞中的转染技术，已成为考察表达蛋白功能的常规生物学手段。其中稳定转染与瞬时转染相比，具有在不同批次实验中基因表达水平差异小和表达持续时间长等优点。本研究利用HCA方法建立的hDOR与PKAcat-EGFP共表达细胞与DOR单转细胞相比，还存在细胞用量少、实验周期短及在96孔板水平即可筛选出阳性克隆等多种优势。与hDOR相关其他药物筛选模型相比，如放射性配体受体结合实验，仅能考察药物与受体的亲和力；［35S］GTPγS结合实验，仅能考察药物对受体后G蛋白的激活能力；而本细胞模型可通过检测hDOR信号通路较下游的信号分子PKA重分布考察药物对受体功能的影响，其过程快速，结果直观，非常适合靶向DOR配体的高通量快速筛选。

PKA作为cAMP依赖性蛋白激酶，其活化受胞内cAMP浓度的影响。未做处理的细胞中，cAMP浓度较低，PKAcat-EGFP在细胞质中呈现高亮度荧光颗粒聚集体；当cAMP浓度升高时，PKAcat-EGFP会从聚集体中释放出来，表现为细胞质荧光颗粒的减少。由于DOR为Gi蛋白偶联受体，激活后抑制AC，阻碍ATP形成cAMP，导致PKAcat-EGFP在细胞质内形成颗粒，与未处理细胞表现一致，因此需加入AC激动剂佛司可林［8］，升高细胞内cAMP浓度，使PKAcat-EGFP在细胞质中呈弥散分布。利用PKA的这种重分布现象即可检测化合物对受体功能的影响［9-10］。

本研究建立CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3细胞模型，通过PKA重分布实验与LANCE cAMP 384试剂盒2种实验均证明其表达的hDOR具有活性，且hDOR在40代以内能稳定表达，表明该细胞模型构建成功，为考察hDOR的功能和信号转导通路，开展高通量筛选，研发出更好、更有效的hDOR激动剂类药物建立了很好的平台，同时也为进一步研究DOR激动剂的药理作用机制奠定基础。