丹参酮ⅡA对鼠新生血管的影响研究*

王科， 铁明慧， 樊涛， 薛平， 张颖

610041 成都，四川大学华西医院 中西医结合科

丹参(唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge根)是活血祛瘀类的代表中药, 《神农本草经疏》中既明确记载其有破症除瘕的功效[1]。而丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中的主要成分是从中药丹参中提取的丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA, TSⅡA)的磺化产物，是丹参的主要活性成分之一。此前的一些基础研究表明TSⅡA在体外能显著抑制胆管癌细胞增殖，并能抑制EGFR基因、凋亡抑制基因Survivin的表达[2-3]，其通过对SAPK/JNK信号通路的影响、下调周期蛋白cyclin A和cyclin D2的表达水平来抑制胰腺癌细胞的增殖[4-5]，可抑制人肺癌细胞株的增殖并影响细胞周期，诱导其凋亡[6]，也有报道TSⅡA在体外对子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、肝癌等细胞也具有显著的抑制增殖，促进凋亡的作用[7-15]。同时在部分临床研究中，也发现了TSⅡA可以增强化疗药物对肿瘤的抑制作用，延缓肿瘤耐药性，减轻化疗的毒副作用，提高患者的生活质量[16-20]。在临床中，抗血管生成已是肿瘤治疗的常用方法[21]，但是到目前为止，关于血管新生的丹参酮ⅡA影响因素研究文献还很少，通过分析TSⅡA对微血管结构与功能及其新生过程，有助于研究人员进一步深入了解TSⅡA作用于血管的机理，同时也为肿瘤血管的正常化治疗提供了理论参考。本文以体外培养方式建立并研究了大鼠腹主动脉环的血管生成模型[22-23]，探讨了TSⅡA对新生微血管的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c 小鼠，雌雄各半，6～8周，20～18g,32只；SD大鼠，SPF级，雌雄各半，6～8周，(200±9)g，16只，饲养地点为四川大学华西实验动物站，选择普通饲料与自由饮水的喂养方式。

1.1.2 实验药物及试剂 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司)，批号:H31022558，10mg/2ml。鼠内皮抑素(ER)、Matrigel(BD Bioscience公司，批号:356234)、碱性成纤维细胞生长因子 (b-FGF)、牛血清白蛋白(BSA)及MCDB131培养基(Sigma公司，批号:010899、E8279、AL133A)，肝素钠(Anlresco公司，批号:051219)，大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体(abcam，批号:ab171207)，戊巴比妥钠(Sigma ，批号:P3761)。

1.1.3 仪器设备 显微镜(Nikon公司，型号:MM-800LFA/LMAF)，酶标仪(北京普朗有限公司，型号:DNM-9602A)，成像系统(尼康，型号:Nikon DS-U3)，冷冻离心机(珠江黑马医学有限公司，型号:HemaMini4K)，超净工作台(SANYO ，Biological Safety Cabinets，ClassⅡ，NUAIR)，CO2恒温培养箱(SANYO ，MCO-15AC)，动物实验器材：手术剪、眼科剪、眼科镊、止血钳(成都科华实验仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 药液配置 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，加生理盐水8mL、18mL，稀释至1mg/mL、0.5mg/mL，储存于4℃的冰箱环境中，使用前需进行摇匀。

1.2.2 小鼠各组用药情况 采用随机分配方式把BALB/c小鼠分为低剂量丹参酮ⅡA组(LG)、高剂量丹参酮ⅡA组(HG)、内皮抑素组(ER)、阴性对照组(NS)共4组，其中每组数量为8只。种植Matrigel之前的3天时间，高、低剂量的丹参酮ⅡA组依次按照每天10mg/Kg、5mg/Kg腹腔注射，同时对阴性对照组采用腹腔注射方式注入同样剂量的生理盐水，并以5mg/Kg的浓度将内皮抑素添加至Matrigel中，混合均匀之后将其注射到内皮抑素组小鼠腹壁中心的皮下组织中。按照上述方式给药持续8天时间。

1.2.3 植入Matrigel 将Matrigel置于4°C冰箱中进行夜间熔化；对高压灭菌处理后的EP管与移液器吸头进行4°C预冷。将配置得到的牛血清白蛋白浓度为100g/L的PBS溶液作为稀释液，使b-FGF稀释后的浓度达到2ug/L，肝素稀释后的浓度达到1U/uL。在给药到达3d时间时，将冰浴处理后的500uL Matrigel与50uL肝素、50uLb-FGF一起充分混合均匀为止；此外，按照5mg/kg的浓度把内皮抑素加到上述混合溶液中作为备用。之后，在冰浴条件下将以上得到的Matrigel采用皮下注射方式注入到各组小鼠的腹部中心部位，要求注射之前需左右晃动针头。5d时间后，采用后颈椎脱臼方式处死小鼠，并沿小鼠腹部中心线进行解剖，为避免出血，需将基质胶栓缓慢剥离，之后经过PBS冲洗2至3次之后再拍照，各组分别选择4块Matrigel种植体作为血红蛋白含量的测试样品，同时在各组中分别选取4块Matrigel种植体置于10%甲醛溶液中进行固定，准备后续对免疫组织进行化学染色。

1.2.4 测定血红蛋白含量 将Matrigel种植体放置在-70°C温度条件下进行过夜脱水，之后在室温条件下将其悬浮在0.5mL浓度为1g/L的TritonX-100溶液中保持2h，再将其转移到4℃的冰箱中放置2h，取出并用吸管将其吹打为悬液状态，利用冷冻离心机在10 000rpm转速下对其进行离心处理10min，用酶标分析仪测试上清液A405nm(血红素的特征吸收波长)处的光吸收度A值，最后以鼠血红蛋白标曲线将测试数据换算为血红蛋白的含量。

1.2.5 制备丹参酮ⅡA含药血清 采用李仪奎教授提出的“通法”进行含药血清制备[17]。SD大鼠采用随机数字表法随机分成丹参酮ⅡA组和生理盐水组，丹参酮ⅡA组12只，生理盐水组2只。其中丹参酮ⅡA组按5mg/kg腹腔注射，生理盐水组则以等量生理盐水进行腹腔注射。按照上述方式给药持续5天时间，最后一次给药之前需在不禁水条件下进行12h禁食。最后一次给药1h之后，以腹腔麻醉方式将4mg/100g戊巴比妥钠注入大鼠体内，将其置于超净工作台上从腹主动脉处完成取血操作，将所得血液静置凝固之后再进行4 000rpm离心处理总共30min实现血清分离，在56°C下对其实施30min的水浴灭活处理，并经0.22μm过滤除菌之后再分装并将其储存于-20°C环境中。

1.2.6 获取与培养腹主动脉环 将SD大鼠进行颈椎脱臼方式处死，再将其浸泡在75%的乙醇中共15min，之后在超净工作台上剪取得到腹主动脉，并在100mm培养皿内采用PBS缓冲液对腹主动脉总共清洗2次，将动脉周边纤维与膜组织去除后，把血管切为长度为1mm至1.5mm的主动脉环，再利用PBS缓冲液对其清洗2次，同时在MCDB131培养基中进行漂洗2次。把动脉环纵切面与培养孔底部保持平行的方式放入已经铺好matrigel基质胶的50uL/well的48孔板中，再把熔化后的matrigel基质胶加到各个孔中，每孔70uL，在5%CO2与37℃条件下进行细胞培养，经过2h孵育后，使基质胶完全凝固。之后，加入100uL不同丹参酮ⅡA含药血清的MCDB131培养基。根据不同浓度丹参酮ⅡA含药血清分组得到：只含有MCDB131培养基的无血清组；添加了10%生理盐水的大鼠血清对照组；80%丹参酮ⅡA含药血清组；70%丹参酮ⅡA含药血清组；60%丹参酮ⅡA含药血清组；50%丹参酮ⅡA含药血清组；40%丹参酮ⅡA含药血清组；30%丹参酮ⅡA含药血清组；20%丹参酮ⅡA含药血清组；10%丹参酮ⅡA含药血清组(将各浓度的丹参酮ⅡA含药大鼠血清添加到MCDB131培养基内)。之后，再将细胞培养箱内放入48孔板进行培养，换液周期为2天。采用倒置显微镜对微血管的每天生长情况进行观察分析，同时做好拍照记录，为各组都设置3个复孔，要求进行3次重复实验。

1.2.7 测定新生微血管的出芽面积 要求由一个人单独完成实验操作、测试、观察与记录。同时，在每天的相同时间对主动脉环进行显微镜观测，研究生长状况，对新生的微血管进行拍照。当生成的血管数量比较多之后，各孔分别从3个平面上对微血管进行拍摄，对这些平面上的微血管面积进行求平均值，将所得数据作为对应孔微血管面积[24-25]，当培养时间达到10天时停止拍摄，最后通过Image-Pro Plus 6.0软件分析图像，计算得到每组新生微血管的出芽面积。

1.2.8 血管结构分析与微血管计数(microvessel density count，MDC) 采用10%甲醛将来自小鼠体内的Matrigel种植体进行固定，3d后对其进行石蜡包埋与切片处理，再进行免疫组化染色或常规HE染色。以免疫组织化学法完成血管内皮细胞 CD31分子的染色，再根据Weidner标准[26]对血管密度进行统计。以100倍光镜对切片进行整体扫描观察，查找高密度血管区域，之后在400倍的高倍镜条件下对4个高密度血管区域进行拍照记录，各高倍镜的视野面积都是150μm×100μm。以Image-Pro Plus 6.0软件对高倍镜条件下观察到的微血管密度进行统计分析，以计算得到的平均值作为最终的微血管数量。此外，利用显微镜对血管内皮与周边细胞进行覆盖状态观察。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 肉眼观察Matrigel种植体

在肉眼观察下，内皮抑素组的Matrigel种植体表现出最淡的颜色；丹参酮ⅡA组的小鼠Matrigel种植体颜色相比阴性对照组略微更淡，这有可能是因为血管数量较低导致的现象，如图1所示。

2.2 小鼠Matrigel种植体内的血红蛋白含量影响因素分析

将获得的Matrigel种植体进行血红蛋白含量测试，通过统计学分析发现，内皮抑素组和高、低剂量丹参酮ⅡA组都表现出比阴性对照组更低的血红蛋白含量(P<0.01)；高、低剂量丹参酮ⅡA组都比内皮抑素组的血红蛋白含量更高(P<0.01)；高剂量丹参酮ⅡA组比低剂量丹参酮ⅡA组具有更高的血红蛋白含量(P <0.01)。(表1)。

2.3 小鼠Matrigel种植体免疫组织的化学染色情况

选择CD31作为血管的内皮细胞标记物，以此实现血管新生内皮细胞的免疫组织化学染色过程。实验结果表明，对照组产生了较多的细胞数量，可以明显看到被染成棕黄色的各个内皮细胞簇以及众多内皮细胞，也可以观察到明显的血管结构，其中内皮细胞具有较深的着色效果；丹参酮ⅡA组比阴性对照组的细胞数量更少，同时内皮细胞的着色更淡，血管结构也相对更加模糊；高剂量丹参酮ⅡA组具有比低剂量丹参酮ⅡA组更多的细胞数；偶尔可以从内皮抑素组中观察到棕黄色的颗粒。如图2所示。

表1 丹参酮ⅡA对小鼠Matrigel种植体中血红蛋白含量的影响

注：与正常组比较1)P<0.01；与内皮抑素组比较2)P<0.01；与丹参酮ⅡA10mg·kg-1组比较3)P<0.01。

图1 各组体内Matrigel种植体颜色比较

图2 丹参酮ⅡA对小鼠 Matrigel种植体CD31蛋白表达的影响(免疫组化，x400)

2.4 对小鼠Matrigel种植体内MDC的影响

与阴性对照组比较丹参酮ⅡA高剂量组的MDC降低(P<0.05)，内皮抑素组与低剂量丹参酮ⅡA组MDC出现了明显下降(P<0.01)；内皮抑素组的MDC低于低剂量丹参酮ⅡA组(P<0.05)，同时也显著低于高剂量丹参酮ⅡA组(P<0.01)；高剂量丹参酮ⅡA组MDC高于低剂量丹参酮ⅡA组(P<0.05)；以上实验结果和血红蛋白的含量测试结果一致。结果如表2所示。

表2 丹参酮ⅡA 对小鼠Matrigel种植体内MDC的影响

注：与正常组比较1)P<0.01；与正常组比较2)P<0.05；与内皮抑素组比较3)P<0.05；与内皮抑素组比较4)P<0.01；与丹参酮ⅡA 10 mg·kg-1组比较5)P<0.05。

2.5 主动脉环的新生微血管形态学分析

除了无血清组以外，对其它各组培养达到3-5d时，都可以在动脉环周边观察到有众多内皮细胞发生增殖与迁移现象，同时大鼠主动脉环也逐渐进入出芽状态。这些出芽细胞表现为长梭形，以放射形态从血管环外膜朝各个方向进行延伸, 最终形成网状结构。培养时间达到10天时，部分新生微血管开始出现萎缩，结构凌乱模糊。结果如图3所示。

2.6 主动脉环新生微血管出芽面积

在培养到达第10天时拍摄停止，以Image Pro分析软件对图像进行测试，统计每组的新生微血管总出芽面积。与对照组比较10%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积减少(P<0.05)，20%、30%、40%、50%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积均明显减少(P<0.01)；70%和 80%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积较对照组高(P<0.01)，60%丹参酮ⅡA含药血清组相比于对照组微血管出芽面积差异无统计学意义(P>0.05)。10%、20%、30%、40%、50%丹参酮ⅡA含药血清组微血管的出芽面积不同组进行对比后发现差异无统计学意义(P>0.05)，和60%、70%和 80%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积比较均明显减少(P<0.05)。但与10%丹参酮ⅡA含药血清比较差异没有统计学意义(P>0.05)。60%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积较较70%和 80%丹参酮ⅡA含药血清组低(P<0.01)，70%和 80%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积比较差异没有统计学意义(P>0.05)，结果如图4所示。

图3 不同浓度血清培养10天后大鼠主动脉环微血管出芽情况(x100)

A.无血清组；B.对照组；C.80%丹参酮ⅡA含药血清组；D.70%丹参酮ⅡA含药血清组；E.60%丹参酮ⅡA含药血清组；F.50%丹参酮ⅡA含药血清组；G.40%丹参酮ⅡA含药血清组；H.30%丹参酮ⅡA含药血清组；I.20%丹参酮ⅡA含药血清组；J.10%丹参酮ⅡA含药血清组。

图4 大鼠主动脉环新生微血管出芽面积(像素)

0为对照组,n=8;a.50%丹参酮ⅡA含药血清组以及40%、30%、20%、10%丹参酮ⅡA含药血清组vs.对照组，P<0.05；b.80%丹参酮ⅡA含药血清组、70%丹参酮ⅡA含药血清组vs.对照组，P<0.01。

2.7 主动脉环培养物免疫组织化学染色结果

主动脉环培养物免疫组织化学染色结果显示，80%、70%丹含药血清组具有更多的细胞数量，可以发现存在比较多的棕黄色内皮细胞，颜色较深区域的内皮细胞数量更多，同时血管结构也更加密集；随着丹参酮ⅡA含药血清浓度降低，细胞数量减少，且血管结构清晰、内皮细胞着色变浅，在丹参酮ⅡA含药血清浓度为50%时，血管环周围仅偶见少量棕黄色内皮细胞或细胞簇；随着丹参酮ⅡA含药血清浓度再次降低(<50%)，血管环周围的细胞数量逐渐增多，微血管分支逐渐增多，结构紊乱。该结果与微血管出芽情况一致。(图5)。

图5 不同浓度血清培养10天后大鼠主动脉环培养物IHC染色结果(×400)

A.无血清组；B.对照组；C.80%丹参酮ⅡA含药血清组；D.70%丹参酮ⅡA含药血清组；E.60%丹参酮ⅡA含药血清组；F.50%丹参酮ⅡA含药血清组；G.40%丹参酮ⅡA含药血清组；H.30%丹参酮ⅡA含药血清组；I.20%丹参酮ⅡA含药血清组；J.10%丹参酮ⅡA含药血清组。

2.8 动脉环培养新生微血管密度

与对照组比较60%丹参酮ⅡA含药血清组组间微血管密度没有差异(P>0.05)；10%丹参酮ⅡA含药血清组微血管密度较对照组减少(P<0.05)；20%、30%、40%、50%丹参酮ⅡA含药血清组微血管密度均明显降低(P<0.01)，该结果与新生微血管出芽面积一致；当丹参酮ⅡA含药血清增加至70%、80%时，微血管密度较对照组增多(P<0.05)。因此，当丹参酮ⅡA的含药血清浓度低于50%的条件下，其浓度上升后，会对血管环新生血管产生更强的抑制效果，导致血管环的新生微血管出现密度下降现象，尤其是当含药血清浓度达到50%时和对照组对比具有明显的差异性；在丹参酮ⅡA含药血清达到50%以上的浓度条件下，当浓度进一步增大后，其对新生微血管的抑制效果会降低，转为促进作用，相关性分析r=0.549，P<0.05。(表3，图6)。

表3 主动脉环新生微血管密度比较(血管数/HP)

注：1)10%丹参酮ⅡA含药血清组vs.对照组(P<0.05)；2)20%丹参酮ⅡA含药血清组、30%丹参酮ⅡA含药血清组、40%丹参酮ⅡA含药血清组、50%丹参酮ⅡA含药血清组vs.对照组，P<0.01；3)70%丹参酮ⅡA含药血清组、80%丹参酮ⅡA含药血清组vs.对照组，P<0.01。

图6 大鼠主动脉环新生微血管密度(血管数·H-1)

3 讨 论

中医对于肿瘤的病因病机学说很多，比如气血亏虚、肾精不足、气血瘀滞，对应着补益气血、补肾填精、活血化瘀等治疗法则。活血化瘀也是一种应用较为普遍的临床肿瘤中医治疗原则。文献研究结果显示，活血化瘀药物能够对肿瘤血管的新生与生成起到抑制效果[27-30]。但另一方面，活血化瘀药物是否会促进肿瘤的转移、进展仍有争议[31]。笔者认为，结合中医理论和此前的很多基础研究，这样的矛盾并不应该简单的理解为负面效应，而是理解为活血化瘀药物在抗肿瘤中具有双向调节作用。可以对非肿瘤情况下的瘀阻血络发挥“疏通”效果，同时对肿瘤血络起到“抑制”效果[32]。类似的药物例如白芍总甙，其在类风湿性关节炎的治疗中也是发挥抗炎和免疫调节作用[33-34]。所谓调节，既不是促进，也不是抑制，而是一种双向作用，体现出中医理论中对立统一的观念。

丹参是活血化瘀代表药物，20世纪上半叶，日本学者首次从丹参中分离得到脂溶性有效成分丹参酮ⅡA，后80年代，钱明堃等对丹参酮ⅡA进行了研究，发现其能够起到较好的心血管药理效果，不过肠道吸收方式的效率较低，无法发挥快速的临床作用，因此首次提出了以磺化反应半合成方式得到了丹参酮ⅡA磺酸钠。本实验中使用的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液是即是其针剂，成分单一，利于分析。其在缺血性脑卒中，慢性心力衰竭，急性心肌梗死，肾血管改变等[35-38]多种疾病的中西医结合治疗中应用广泛，作用确切，甚至已被列入专家共识[39]。结合中医“异病同治”的理论，我们将其运用到肿瘤疾病的治疗中。

Matrigel[40-41]主要成分为层粘连蛋白，Ⅳ型胶原蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白，纤维原生长因子，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂和其他生长因子，其能够模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，能够有效促进血管内皮细胞的粘附和分化，在体内内皮血管生成系统研究中使用广泛。内皮抑素是1997年O’Reilly 等从培养的小鼠内皮细胞瘤( EOMA)上清中分离纯化的一种内源性血管生成抑制剂，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂[42-43]，近年来倍受关注，目前在美国已进行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，并有可能成为新一代抗肿瘤药物。我们将其选为对照药物，就是希望比较其与丹参酮ⅡA的效果。实验的结果没有让我们失望，通过对小鼠Matrigel种植体的检测发现：在血红蛋白含量指标方面，对比阴性对照组，丹参酮ⅡA高、低剂量组与内皮抑素组都较低(P<0.01)；在此指标上，相比内皮抑素组，丹参酮ⅡA低、高剂量组都较高(P<0.01)；对比丹参酮ⅡA高剂量组，丹参酮ⅡA低剂量组较低(P<0.01)。对小鼠Matrigel种植体内微血管计数发现其结果和血红蛋白含量检测结果一致。也就是说高、低剂量丹参酮ⅡA组都可以起到抑制Matrigel种植体血管生成的效果，且与浓度相关。

通过体外培养大鼠腹主动脉环实验中，无血清组没有新生血管生成。与对照组比较，10%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积减少(P<0.05)，20%、30%、40%、50%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积均明显减少(P<0.01)；70%和 80%丹参酮ⅡA含药血清组微血管出芽面积较对照组高(P<0.01)，在微血管出芽面积指标上，60%丹参酮ⅡA含药血清组同对照组不存在明显区别(P>0.05)。对培养物新生微血管计数结果与微血管出芽面积一致。在丹参酮ⅡA含药血清浓度不大于50%时，此药物抑制血管环新生血管水平会随着自身浓度的提高而增强，同时会逐渐降低血管环新生微血管密度，尤其在含药血清浓度等于50%时，对比对照组，存在显著区别，经相关性分析(r=-0.563，且P<0.01)；在丹参酮ⅡA含药血清浓度不大于50%时，在药物浓度加大下，会慢慢降低自身抑制血管环新生微血管功能，转为促进作用，相关性分析(r=0.549，P<0.05)。即丹参酮ⅡA对血管环新生血管具有抑制和促进双向的作用，其作用趋势与丹参酮ⅡA亦呈现浓度依赖关系。

当然，由于条件与经费有限，如果使用激光共聚焦显微镜、活体荧光显微镜、多光子激光扫描显微镜等动态观察，在观察结构变化同时了解药物作用的时间窗，实验结果将更精确，而且更有利于指导其后期在临床中与现有治疗技术的结合。

本实验通过分析丹参酮ⅡA对血管功能及其结构所产生的影响，为进一步研究丹参酮ⅡA对血管作用机理以及实现肿瘤血管正常化提供了理论参考。此外，本文还探讨了活血化瘀药物的治疗机理，可以为临床用药提供一定的参考。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统学术不端检测；

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

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