戈米辛D与α—葡萄糖苷酶的相互作用研究

张慧+吴媛媛+黄晨晔+张晓静+颜继忠

[摘要] 该文研究了戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的相互作用。以PNPG作为底物测定戈米辛D的抑制率，戈米辛D的IC50为0.59 mmol·L-1，略高于阿卡波糖的IC50 1.95 mmol·L-1，其抑制类型为可逆非竞争性抑制，抑制常数Ki=4.026 g·L-1。通过AutoDock Vina分子对接研究了戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的结合模式，结果显示，戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的结合能量值为-7.7 kcal·mol-1，优于阿卡波糖的能量值-6.6 kcal·mol-1，且戈米辛D作用的氨基酸殘基数目超过了阿卡波糖。经紫外光谱分析，发现戈米辛D与α-葡萄糖苷酶结合之后改变了酶二级构象中的芳香族残基微环境，使其极性减小。

[关键词] 戈米辛D； α-葡萄糖苷酶； 分子对接； 抑制率； 相互作用

[Abstract] This paper describes a study exploring the interaction between gomizine D and α-glucosidase. The inhibitory activity of α-glucosidase by gomizine D was determined using PNPG as substrates Gomizine D gave the IC50 value of 0.59 mmol·L-1， which was higher than that of acarbose （1.95 mmol·L-1）. Gomizine D was a reversible and non-competitiveα-glucosidase inhibitor with an inhibition constant Ki=4.026 g·L-1. The binding mode between gomizine D and α-glucosidase was analyzed by AutoDock Vina molecular docking software. The lowest energy of Gomizine D binding to α-glucosidase was -7.7 kcal·mol-1， which was lower than that of acarbose （-6.6 kcal·mol-1）. After binding with gomizine D， UV spectroscopy analysis displayed that the microenvironment of aromatic residue in the secondary structure of α-glucosidase was changed， and the polarity of protein was reduced.

[Key words] gomizine D； α-glucosidase； molecular docking； inhibition rate； interaction

研究小分子与靶蛋白的相互作用对揭示药物发挥疗效的实质有着重要意义。α-葡萄糖苷酶是一类能够从含有α-糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基酶的物质总称[1-3]，它位于小肠刷状细胞表面，是人体中水解多糖的关键酶类。目前临床上广泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇[4-5]，然而，西药在有效降低血糖的同时也存在诸多的安全性问题和不良反应，因此，寻找安全、有效的降糖新药一直是研究热点。

参芪降糖颗粒是由人参、黄芪、五味子等传统中药材组成的复方制剂，临床上主要治疗Ⅱ型糖尿病患者的气阴两虚证，属于国家二级中药保护品种[6-7]。课题组前期利用超滤-质谱法从参芪降糖颗粒中筛选出一系列的降糖活性小分子，其中，戈米辛D，见图1，是五味子的一种木脂素类成分，对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用。为了进一步探讨戈米辛D的降糖分子机制，本文从抑制率、抑制类型、分子对接、紫外光谱等多个方面对戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的相互作用进行了研究，以期开发新一代的降糖药物。

1 材料

小型高速离心机（艾本德中国有限公司），超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），恒温水浴锅（上海亚荣生化器厂），酶标仪（Tecan company），电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

α-葡萄糖苷酶和阿卡波糖均购自Sigma公司，戈米辛D购自成都曼斯特生物科技有限公司，PNPG购自北京雅安达生物技术有限公司，碳酸钠购自太仓美达试剂有限公司，乙酸铵购自温州市化学用料厂，均为分析纯。

2 方法

2.1 测定戈米辛D的抑制率 以PNPG为底物，96孔板为反应载体，测定阿卡波糖和戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制率。用2 mmol·L-1戈米辛D稀释到不同浓度，加入0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶，在37 ℃水浴下反应15 min，再加入2.5 mmol·L-1 PNPG溶液20 μL，37 ℃下反应15 min，加入0.01 mol·L-1碳酸钠溶液100 μL终止反应，在405 nm下测定吸光度值，并计算抑制率。

酶活性抑制率=[（A阴性- A空白）-（A样品- A样品对照）]/（A阴性- A空白）×100%

式中，A阴性为不加样品抑制剂酶和PNPG完全反应吸光；A样品为加样品抑制剂后酶和PNPG反应的吸光；A样品对照为只加样品和PNPG的吸光；A空白为乙酸铵缓冲液吸光。

样品组设定6 个浓度梯度，每组设3个平行对照，以抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制得到抑制率曲线。

2.2 戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学研究 在上述实验条件下，固定α-葡萄糖苷酶的浓度，测定不同戈米辛D浓度条件下，底物浓度对α-葡萄糖苷酶催化速率的影响，每组设3个平行对照，以吸光度为表征反应速率v，底物浓度为s，1 / [v]为纵坐标，1 / [s]为横坐标根据Lineweaver Burk 双倒数作图[8-9]，计算并评估戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型。endprint

2.3 Auto-Docking分子对接 用AutoDock Vina软件模拟戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的分子对接情况。根据文献报道本文选择α-葡萄糖苷酶晶体结构的PDB ID为2QLY[10]，三维晶体结构见图1。用ChemBio Draw画出戈米辛D和阿卡波糖的结构式，导入ChemBio 3D将两者的三维结构能量分别降至最低。采用遗传算法（genetic algorithm，GA）计算与蛋白质结合的药物分子的可能构象。在对接过程中，最多考虑了化合物的10个构象，取结合自由能最低的構象用来做进一步的分析。

2.4 紫外光谱法 配制戈米辛D不同浓度分别为0.25，0.5，1.25，2.5，5.0 μmol·L-1。 α-葡萄糖苷酶浓度稀释至0.5 mg·L-1。100 μL不同浓度戈米辛D溶液加900 μL酶溶液混合装于1.5 mL EP管中，以乙酸铵缓冲液作为对照，用紫外分光光度仪扫描并观察戈米辛D与α-葡萄糖苷酶相互作用前后的紫外光谱图[11]。

3 结果与讨论

3.1 α-葡萄糖苷酶反应体系的优化 为了小分子与酶蛋白在适宜条件下反应，实验前期先对α-葡萄糖苷酶的反应条件进行了优化，包括反应时间、缓冲液pH以及水浴温度等。结果显示，戈米辛D的抑制率与反应时间呈现良好的线性关系，随着时间延长，戈米辛D的抑制率增加，当反应时间在15 min之后，上升趋势变缓。，当缓冲液pH为6.7时，抑制率达到最高值，见图2B。图2C显示反应温度对抑制率的影响也较大，37 ℃为α-葡萄糖苷酶的最佳反应温度。综上确定戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的最佳反应条件如下：水浴温度为37 ℃，pH 6.7，反应时间为15 min，后续实验均在此反应条件下进行。

3.2 测定戈米辛D的酶抑制活性 阿卡波糖是临床上常用的一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，本实验选择阿卡波糖作为阳性药[12]。基于上述最佳反应条件，平行检测阿卡波糖与戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。阿卡波糖的抑制率与浓度呈线性相关，随着阿卡波糖浓度不断上升，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率不断增加，当浓度为9 mmol·L-1时，对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高达82.73%，经计算得阿卡波糖的IC50为1.95 mmol·L-1，见图3A。相比于阿卡波糖，戈米辛D的酶抑制活性最高，IC50为0.59 mmol·L-1，戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线见图3B。

3.3 戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型 首先通过对α-葡萄糖苷酶中加入戈米辛D和不加戈米辛D的反应溶液检测吸光度的变化，计算反应速度，以浓度为横坐标，反应速度为纵坐标作图得到两条直线，对比两条直线的变化，在横坐标中没有平移，可以判断戈米辛D对α-葡糖苷酶的抑制是可逆的。

在此基础上，进一步研究戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为非竞争性抑制，通过以1/[s]为横坐标，1/[v]为纵坐标双倒数作图。固定α-葡萄糖苷酶的浓度，分别用0，400，800 μmol·L-1的戈米辛D与α-葡萄糖苷酶相互作用，得出3条双例数曲线分别是：Y=0.169X+1.103，Y=0.158X+1.035，Y=0.151X+0.997。由双倒数曲线图可见戈米辛D 对α-葡萄糖苷酶的抑制时典型的非竞争性抑制，并且由X轴的截距可求出戈米辛D的表观速率常数Km=0.153 0 mol·L-1，由Y轴截距数据可求出戈米辛D的抑制常数Ki=4.026 g·L-1，见图4。

3.4 紫外光谱研究 紫外-分光光谱法是检测小分子与蛋白质是否形成复合物的有效方法，可以研究戈米辛D对α-葡萄糖苷酶二级结构的影响。在190～400 nm的波长下，通过测定并观察其紫外图谱，可以得到蛋白质的主链结构信息。不同浓度的戈米辛D与α-葡萄糖苷酶结合后的紫外光谱变化，见图5。

戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的反应体系在波长 220 nm，280 nm处有2个明显的吸收峰，在280 nm处的紫外吸光度可以反映出蛋白质的芳香族的氨基酸残基变化。随着戈米辛D浓度的增加，体系的吸光度下降，说明戈米辛D与α-葡萄糖苷酶存在相互作用。而且随着戈米辛D浓度增大，280 nm处的峰形有轻微红移，说明戈米辛D和α-葡萄糖苷酶结合后改变了α-葡萄糖苷酶的芳香族残基的微环境，使其极性减小，即戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的结合改变了α-葡萄糖苷酶的构象。

3.5 戈米辛D对α-葡萄糖苷酶的分子对接 本实验采用AutoDock Vina软件研究戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的分子对接模式，对接图见图6。AutoDock软件显示配体-受体的相互作用模式，图6A和6C分别表示在最低能量下，阿卡波糖和戈米辛D结合在α-葡萄糖苷酶的同一个活性疏水口袋。图6B和6D螺旋微观模型表示α-葡萄糖苷酶活性位点氨基酸残基，中间棍状模型分别是阿卡波糖和戈米辛D。从图中可以看出，阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶的ARG-471，GLY-210，LYS-195，TRP-43等氨基酸残基有相互作用，戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的TYR-605，GLY-604，LEU-499，ASP-474，THR-205，ASP-542等氨基酸残基有相互作用，两者之间的虚线表示配体-蛋白中的氢键相互作用。并且从图中可以看出戈米辛D与α-葡萄糖苷酶上的结合位点数目超过了阿卡波糖。

根据文献报道，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为非竞争性与竞争性抑制混合型，而戈米辛D为非竞争性抑制剂。比对两者的分子对接结果表明，两者结合的活性口袋一致，但是结合的氨基酸残基有所区别，相互作用力则主要为氢键作用。

4 小结

糖尿病是一类严重的疾病，且患者人数众多，严重威胁着人们的生命健康，我国以碳水化合物为主食，所以α-葡萄糖苷酶抑制剂在糖尿病的治疗过程中能发挥更好的效果[13]。本文的研究对象——戈米辛D，是从传统中药方剂参芪降糖颗粒中筛选得到的一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，研究表明其与α-葡萄糖苷酶之间存在可逆型非竞争性抑制，两者主要以氢键的形式相互作用，结合之后可改变α-葡萄糖苷酶的二级构象。在前期筛选结果中，与戈米辛D结构类似的潜在α-葡萄糖苷酶抑制剂，还有戈米辛J、五味子醇甲、五味子醇乙等木脂素类化合物，经初步实验结果推测，这些化合物与α-葡萄糖苷酶之间都存在一定的相互作用。本文研究进一步确证了参芪降糖颗粒在体内可对α-葡萄糖苷酶产生一定的抑制作用，从而起到较好的降糖效果。综上所述，研究戈米辛D与α-葡萄糖苷酶的相互作用，一方面有助于开发新的降糖候选药物，另一方面对阐明参芪降糖颗粒的药效物质基础有一定的意义。endprint