基于分子模拟技术筛选大黄、羌活、秦艽的5—LOX、LTA4H抑制剂

谷宇+张栩+陈艳昆+赵博文+张燕玲

[摘要] 5-LOX（5-lipoxygenase）和LTA4H（leukotriene A4 Hydrolase）作為花生四烯酸代谢途径中生成炎症介质白三烯（LTs）的重要支路，是抗炎药物研究的关键靶点。大黄、羌活、秦艽3味中药具有明确的抗炎活性。该文以5-LOX，LTA4H靶点为研究载体，利用DS4.0（discovery studio）中的Hiphop模块构建靶标抑制剂药效团初步筛选3味中药的成分数据库，获得5-LOX和LTA4H潜在活性成分。利用CDOCKER模块进行进一步筛选药效团初筛所得成分，基于原配体的打分值以及关键氨基酸建立筛选规则，最终得到5-LOX潜在活性抑制剂12个，包括原矢车菊素B2-3，3′-O-双没食子酸酯、revandchinone 2在内的大黄成分6个，包括二十二烷酸在内的羌活成分4个以及褐煤酸甲酯、N-二十二烷酮-O-氨基苯甲酸乙酯2个秦艽成分；得到LTA4H潜在活性抑制剂7个，包括大黄中的revandchinone 1，revandchinone 4，羌活中的二十三烷酸、二十四烷酸以及二十烷酸甲酯，秦艽中的褐煤酸甲酯、N-二十二烷酮-O-氨基苯甲酸乙酯。该研究能够高效、低耗的筛选3味中药的5-LOX、LTA4H潜在抑制剂，为发现3味中药中发挥抗炎药效的化学质量指标提供助力，以推动对于3味中药的全程质量控制。

[关键词] 抗炎； 5-LOX； LTA4H； 药效团； 虚拟筛选； 分子对接； 中药

[Abstract] 5-lipoxygenase （5-LOX） and leukotriene A4 hydrolase （LTA4H）， as the major targets of 5-LOX branch in the arachidonic acid （AA） metabolic pathway， play an important role in the treatment of inflammation. Rhei Radix et Rhizoma， Notopterygii Rhizoma et Radix and Genitana Macrophyllae Radix have clear anti-inflammation activities. In this paper， the targets of 5-LOX and LTA4H were used as the research carrier， and Hiphop module in DS4.0 （Discovery studio） was used to construct ingredients database for preliminary screening of three traditional Chinese medicines based on target inhibitor pharmacophore， so as to obtain 5-LOX and LTA4H potential active ingredients. The ingredients obtained in initial pharmacophore screening were further screened by using CDOCKER module， and the screening rules were established based on the score of initial compound and the key amino acids to obtain 12 potential 5-LOX inhibitors and 7 potential LTA4H inhibitors. To be more specific， the potential 5-LOX inhibitors included 6 ingredients in Rhei Radix et Rhizoma， such as procyanidins B2-3，3′-O-double gallate and revandchinone 2； four ingredients in notopterygium， such as dodecanoic acid and so on. On the other hand， potential LTA4H inhibitors included revandchinone 1， revandchinone 4 in Rhei Radix et Rhizoma， tridecanoic acid， tetracosanoic acid and methyl eicosanoate in Notopterygii Rhizoma et Radix， montanic acid methyl ester and N-docosanoyl-O-aminobenzoate in Genitana Macrophyllae Radix and so on. The molecular simulation methods were highly efficient and time-saving to obtain the potential inhibitors of 5-LOX and LTA4H， which could provide assistance for discovering the chemical quality indicators of anti-inflammatory efficacy of three Chinese herbs， and may be helpful to promote the whole-process quality control of three Chinese herbs.endprint

[Key words] anti-inflammatory； 5-lipoxygenase； leukotriene A4 hydrolase； pharmacophore； virtual screening； molecular docking； traditional Chinese medicine

花生四烯酸（AA）代谢途径是生物体内广泛存在并具有强大生物活性的代谢体系，与生物体内炎症反应具有直接联系，花生四烯酸的代谢主要通过2条通路：①在环氧化酶（cyclooxygenase，COX）作用下生成前列腺素（prostaglandin，PGs）；②在脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）作用下生成白细胞三烯（leukotrienes，LTs）、脂质过氧化物。其中代谢途径中的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）、白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）是抗炎类药物设计的重要靶标。

5-脂氧合酶（5-LOX）通路是花生四烯酸代谢途径中的一条重要支路，其终产物白三烯（LTs）是参与炎症反应的重要炎症介质[1]。在这条通路上，5-LOX在激活蛋白的协助下催化AA生成白三烯A4（LTA4），在白三烯A4水解酶（LTA4H） 的催化下产生白三烯B4（LTB4），LTB4 是生物体内最强的白细胞趋化因子之一[2]，可以通过激活并聚集许多炎性和免疫细胞 [3-5]引发类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）病人关节肿痛、骨质破坏等炎症反应；通过诱导溶酶体酶与活性氧的释放介导血管损伤，参与系统性红斑狼疮皮肤、肾脏等组织的炎症反应及组织损伤[6]。因此，5-LOX及LTA4H作为花生四烯酸代谢途径中的重要靶标，研究5-LOX，LTA4H的双效抑制剂对抗炎类药物设计具有重要的研究意义。

中药在治疗炎症方面具有广泛的应用，例如大黄、羌活和秦艽这3味具有抗炎潜在活性的西北特色中药材。大黄药性寒凉，清热解毒、抗炎镇痛作用良好，对动脉粥样硬化急性胆囊炎、胰腺炎、腹膜炎及心血管炎症等治疗效果明显[7-8]；羌活辛散祛风、味苦燥湿、性温散寒，具有祛风胜湿止痛的功效，主治风寒湿痹肢节疼痛，研究表明羌活水煎液具有显著的抗炎镇痛作用[9]；秦艽具有祛风湿、止痹痛、退虚热、清湿热等功效，用于风湿痹痛、筋脉拘挛、骨节酸痛、中风手足不遂及骨蒸潮热、小儿疳积发热、湿热黄疸等病症[10]。研究表明，秦艽醇提物能显著减轻佐剂性关节炎大鼠关节肿胀，降低关节炎指数，改善关节滑膜增生[11]。然而，现行药典中制定的针对以上3味中药材的质量指标成分较为单一，量效关联差，对于其治疗炎症的具体疗效指向尚不明确。因此，需要发现上述3味中药具有潜在抗炎活性的指标性成分，以推动3味西北特色中藥材的全程质量控制。

本研究以大黄、羌活和秦艽作为研究载体，从中药成分数据库中搜集以上3味中药化学成分构建中药成分数据库。随后利用已知的 5-LOX和LTA4H抑制剂分别构建Hiphop药效团模型，结合分子对接技术分别对中药成分数据库中的成分进行虚拟筛选，发现潜在的具有5-LOX和LTA4H抑制活性的化学成分，并在一定程度上阐释其针对2个靶标的作用机制。

1 材料与方法

1.1 3味中药成分数据库

基于多个中药化学成分数据库，包括TCMdb2009数据库（ traditional Chinese medicine database，TCMD）、CVDHD 数据库[12] （cardiovascular disease herbal database）、台湾中医药资料库[13]（TCM database@Taiwan），以及关于3味中药的相关文献[14-16]，建立了3味中药的成分数据库，以备筛选所用。所建数据库中包含大黄成分226个、羌活成分133个、秦艽成分55个。其中包括大黄中的大黄酚、大黄素、芦荟大黄素，秦艽中的秦艽酰胺、栎瘿酸以及羌活中的γ-氨基丁酸、去氢羌活内酯等3味中药中具有代表性的药效成分。

1.2 药效团研究

1.2.1 药效团数据来源 在Binding Database（http： //www. bindingdb.org/）中分别输入靶标名称5-lipoxygenase和leukotriene A4 hydrolase。其中检索得到对人源5-LOX具有抑制活性的化合物508个，对人源LTA4H具有抑制活性的化合物535个。分别优选其中结构差异性大且具有一定活性梯度的化合物作为训练集，其中5-LOX抑制剂药效团训练集含有18个化合物，LTA4H抑制剂药效团训练集含有16个化合物。5-LOX与LTA4H训练集化合物的结构与IC50分别见图1，2。从5-LOX与LTA4H各自剩余化合物中分别随机选取活性化合物100个，与来源于Drugbank中的300个非活性化合物共同组成2个靶标药效团的测试集。

1.2.2 药效团模型的构建 利用Discovery Studio 4.0（DS 4.0）对训练集和测试集化合物进行构象分析，采用BEST方法，能量阈值为20 kcal·mol-1，最大构象数目为255个。分别选取训练集中抑制活性高且结构差异较大的化合物，Principal值设为2，MaxOmitFeat值设为0，表明这些化合物分子活性相对较强，在药效团产生过程中应当作模板分子来进行重点考虑，所产生的药效团模型每个特征都必须与这些化合物匹配；选取其中抑制活性一般的化合物，Principal值设为1，MaxOmitFeat值设为1，表明这些分子活性一般，在药效团产生过程中重要性也一般，所得到的药效团模型药效特征与这些化合物部分匹配；选取其中活性极低的2个化合物，Principal值设为0，MaxOmitFeat值设为2，表明这2个化合物在药效团模型产生过程中不会被考虑在内，只用于选择性地定义排除体积。选中训练集中Principal值设为2的化合物，生成药效特征元素，识别结果包括氢键受体（hydrogen bond acceptor，A）、疏水基团（hydrophobic region，H）、氢键供体（hydrogen bond donor，D）、正电中心（positive ionizable，PI）、芳环（ringaromatic，R）5类药效特征。基于药效特征识别结果，利用以上5类特征元素进行组合生成药效团模型，生成排除体积（maximum excluded volumes，EV）个数设置为3，LTA4H设置为5。endprint

1.2.3 药效团模型的评价验证 利用测试集对构建的模型进行验证，根据3个评价指标选择最优的药效团模型，分别是活性化合物有效命中率（HRA）、辨识有效性指数（IEI）、综合评价指数（CAI） [17]。

HRA值越高说明所得到的药效团识别活性化合物的能力越强；IEI值越大说明所得到的药效团辨识活性化合物和非活性化合物的能力越强；CAI值越高说明所得到的三维药效团的数据库搜索能力越好。

1.2.4 数据库的初步筛选 从DrugBank数据库 （https：//www.drugbank.ca/）中分别检索得到针对5-LOX和LTA4H具有抑制活性的上市药物作为阳性药，下载其化合物3D结构并与最优药效团进行匹配。采用2个靶标的最优药效团模型对大黄、羌活和秦艽3味中药成分数据库进行初步筛选，搜索模式为Best Search，匹配模式为柔性匹配，其余为默认参数。最终保留与最优药效团完全匹配且匹配值高于抑制活性最高阳性药的化合物用于分子对接研究。

1.3 分子对接研究

1.3.1 分子对接数据来源 2个靶标的蛋白三维结构从PDB数据库（http： //www.rcsb.org）中下载获得，优先选择解析度较高、复合抑制剂且来源为人源的晶体结构作为研究载体，最终确定PDB代码分别为3V99和2R59的蛋白晶体结构作为5-LOX和LTA4H的分子对接晶体结构。随后对晶体结构进行以下处理：删除多余蛋白质构象、删去水分子、补全不完整残基、加氢以及分配相关电荷。处理后的蛋白用于分子对接研究。

1.3.2 原配体与药效团初筛所得化合物的对接研究 基于晶体复合物中的原配体定义活性口袋，抽出原配体，分别用DS4.0中的Libdock与CDOCKER方法将原配体对接到各自的活性口袋中，计算初始复合物中原配体的分子构象与对接后的分子构象的均方根偏差（RMSD），若RMSD<2.0，则证明对接所得分子构象可以在一定程度上还原配体与受体的结合模式，从而证明所选择的对接方法与参数设置具有合理性。将药效团模型筛选得到的化合物对接进入先前定义好的活性口袋中，以原配体与受体对接打分值的80%作为阈值，选择对接打分值高于阈值且作用模式与原配体-受体作用模式近似的化合物作为靶标的潜在抑制剂。

2 结果与讨论

2.1 5-LOX药效团

基于训练集化合物计算得到10个HipHop药效团模型，打分值（Rank）在150～154，除Model4具有3个H，其余模型均具有2个A、2个H、1个EV，模型信息和评价结果见表1。Model1命中活性化合物94個，其有效活性命中率最高，其IEI值最高为2.474，CAI值最高为2.349，表明其搜索得到的三维药效团的数据库搜索能力越好。因此 Model1被选为最优模型，用来筛选3味中药成分数据库。此外，最优药效团模型可与阳性药完全匹配，匹配信息见表2，其中匹配值最高的为马索丙考（masoprocol），匹配结果见图3。

2.2 LTA4H药效团

基于训练集化合物计算得到10个HipHop药效团模型，打分值（Rank）在174～186。均具有2个A、2个H、3个EV，模型信息和评价结果见表3。Model1命中活性化合物99个，其有效活性命中率最高，其IEI值最高为2.623，CAI值最高为2.596，表明其搜索得到的三维药效团的数据库搜索能力越好。因此 Model1被选为最优模型，用来筛选3味中 药成分数据库。此外，最优药效团模型可与阳性药完全匹配，匹配信息见表2，其中匹配值最高的为（2S）-2-氨基-5-氧代-5-[（4-苯基甲氧基苯基）氨基]

2.3 3味中药成分数据库初步筛选

利用5-LOX抑制剂的最优药效团模型筛选大黄、羌活和秦艽3味中药成分数据库，共筛得大黄成分76个、羌活成分66个、秦艽成分23个，保留其中Fitvalue值高于最优阳性药（0.896 143）的化合物，用于进一步的分子对接研究。其中预测活性较高化合物茜素已有文献报道具有明确的抗炎活性，可抑制结缔组织渗透性[12]；化合物4-松油醇已有文献报道可抑制脂多糖活化的人外周血单核细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10，具有平喘的作用[13]，证 明模型具有一定的可靠性。

利用LTA4H抑制剂的最优药效团模型筛选3味中药成分数据库，共筛得大黄成分73个、羌活成分62个、秦艽成分17个，保留其中Fitvalue值高于 最优阳性药（0.890 381）的化合物，用于进一步的分子对接研究。

2.4 分子对接

2.4.1 5-LOX分子对接筛选 利用5-LOX所选晶体结构的原配体定义活性口袋，其活性口袋信息及计算结果见表4。将筛选得到的具有类药性质且Fitvalue值高于最优阳性药的化合物进行分子对接研究，将具有类药性质且匹配度在0.896 143以上的165个潜在活性化合物对接到活性口袋中，根据均方根偏差较低的原则，选择CDOCKER进行对接，对接阈值为44.74，以化合物打分值高于阈值，且与关键氨基酸发生相互作用为筛选原则，筛选得到6个大黄成分、羌活成分4个、秦艽成分2个筛选结果见表5。

大黄中的成分revandchinone 2与5-LOX中的ASN554和ALA672形成氢键相互作用，与VAL178、LEU607、PHE610形成疏水性相互作用；羌活中的14-甲基十六烷酸与5-LOX中的VAL671、ALA672形成氢键相互作用，与HIS372形成疏水性相互作用；秦艽中的大叶苷C与5-LOX中的ASN554、VAL671、ALA672形成氢键相互作用，与HIS367、LEU368、HIS372、ALA410形成疏水性相互作用，见图5～7。以上3味中药对应的3种成分均与ALA672发生氢键相互作用，revandchinone 2和大叶苷C均与ASN554形成氢键相互作用，14-甲基十六烷酸和大叶苷C均与VAL671形成氢键相互作用。因此，可以将ASN554、VAL671、ALA672视为配体与5-LOX相互作用发挥抑制活性的关键氨基酸。endprint

2.4.2 LTA4H分子对接筛选 利用LTA4H所选晶体结构的原配体定义活性口袋，其活性口袋信息及计算结果见表4。将筛选得到的Fitvalue值高于阳性药（0.890 381）的化合物进行分子对接研究，将具有类药性质且匹配度在0.890 381以上的152个潜在活性化合物对接到活性口袋中，根据均方根偏差较低的原则，选择CDOCKER进行对接，对接阈值为61.90，以化合物打分值高于阈值，且与关键氨基酸发生相互作用为筛选原则，筛选得到2个大黄成分、3个羌活成分、2个秦艽成分，筛选结果见表6。

大黄中的成分revandchinone 4与LTA4H中的GLY345、SER380、GLU384发生氢键相互作用，与PHE314、LEU369、PRO374、LYS565发生疏水性相互作用；羌活中的二十三烷酸与LTA4H中的TYR267、GLY268、ARG563发生氢键相互作用，与ALA137、TYR378发生疏水性相互作用；秦艽中的褐煤酸甲酯与LTA4H中的ARG537、LYS565发生氢键相互作用，与PHE314、VAL367、PRO382发生疏水性相互作 用，见图8～10。

3 结论

随着研究技术的不断进步，AA及其代谢产物在炎症反应中的作用逐渐被发现，是治疗炎症引发的相关疾病的重点研究对象。其中，5-LOX通路可以诱发炎症的级联反应，是AA代谢通路中的重要分支，其中涉及的关键酶，包括5-LOX和LTA4H均为治疗炎症诱发的类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病的关键靶点。

本文通过构建5-LOX抑制剂和LTA4H抑制剂的Hiphop药效团模型，初步筛选了大黄、羌活、秦艽3味中药成分数据库，选择匹配值大于阳性药的成分进行分子对接研究，将对接CDOCKER打分值大于原配体打分值的80%的成分作为靶标的潜在活性抑制剂。综合考虑药效团匹配值、分子对接打分值和成分与靶标之间的相互作用，选择了6个大黄成分、4个羌活成分和2个秦艽成分作为5-LOX的潜在抑制剂；2个大黄成分、3个羌活成分和2个秦艽成分作为LTA4H的潜在抑制剂。针对5-LOX、LTA4H 2个靶标，大黄中的revandchinone 4，羌活中的二十三烷酸、二十四烷酸，以及秦艽中的褐煤酸甲酯这4个成分均具有较高的药效团匹配值和分子对接打分值，可作为5-LOX、LTA4H的双效抑制剂，有望成为抗炎新药研发的先导化合物。本研究高效、低耗的筛选了3味中药的5-LOX、LTA4H潜在抑制剂，为发现3味中药中发挥抗炎药效的化学质量指标提供助力，对于推动3味中药的全程质量控制具有一定的现实意义。

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[责任编辑 孔晶晶]endprint