高分子修饰/无机晶体固定化酶研究进展

白云岫，曹 逊，戈 钧

(清华大学 化学工程系 工业生物催化教育部重点实验室，北京 100084)

相比于传统催化剂，酶具有催化速率快、区位和立体选择性高、反应条件温和等特点，在化工制造、食品生产、医药合成以及分析检测等领域中得到广泛应用[1]。然而，天然酶存在稳定性差和难以重复使用的问题，同时在有机溶剂中容易发生团聚，引起失活，应用范围受到了较大限制。

在过去的几十年里，许多研究采用蛋白质工程、酶化学修饰/固定化技术等方法，提高了酶的活性、稳定性、有机溶剂耐受性和底物亲和力等[1]。其中，酶固定化可以使酶分子与载体之间形成多点连接，有效提高蛋白分子空间构象的稳定性，因此是一种有效提高酶稳定性的方法，但同时可能会带来酶催化活性的较大损失。近年来，研究者开发出了很多新的酶固定化方法[2-7]。与传统固定化方法相比，采用新型功能高分子修饰[8]和无机纳米晶体包埋等方法[9-10]，可以制备具有高催化活性的固定化酶，甚至可以获得高于自由酶的表观活性，同时显著提高酶在高温和有机溶剂中的稳定性。

本文中，笔者将主要从功能高分子修饰、无机晶体包埋以及金属有机骨架化合物(metal-organic frameworks,MOFs)晶体包埋3个方面介绍近年来固定化酶领域的一些研究进展。

1 酶-Pluronic结合物

很多酶催化反应需要利用有机溶剂溶解反应物，同时抑制副反应发生，以降低水产生的副作用。然而，大多数在生物体内有着很高催化活性的酶在有机相中的催化活性会大幅度降低。这种现象的产生很大程度上是由于酶分子在有机溶剂中难以溶解，以悬浮聚集体形式进行催化，使得酶的活性位点难以与反应底物有效接触。针对此问题，Zhu等[8]研究了采用聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic)[11]共价修饰酶分子来制备酶-Pluronic结合物的方法。利用酶-Pluronic结合物良好的有机溶剂相容性，在常规反应温度范围内(20～40 ℃)，结合物可以溶解于常见有机溶剂(如甲醇、甲苯和四氢呋喃等)，进行均相催化，降低了有机相酶催化反应的传质阻力，从而使有机溶剂中酶催化的表观活性比天然酶提高了几个数量级。同时，由于酶-Pluronic结合物在有机相中受温度影响的特性，即当酶催化反应完成后，降低体系温度至4 ℃就可以使得酶-Pluronic结合物形成沉淀，从而方便对其进行回收和重复使用。

在此基础上，进行了酶-Pluronic结合物在有机相酶催化合成医药化学品中的应用探索[12-14]。例如，Zhang等[12]报道了在甲基异丁基酮溶剂中，以脂肪酶-Pluronic结合物为催化剂，采用化学-酶法催化合成抗癌药物戊柔比星的方法，结果发现：脂肪酶-Pluronic结合物在有机相中的催化速率达到了天然酶的11倍，底物转化率达到94%，戊柔比星纯度可达98%以上。并且，在重复使用7次之后，脂肪酶-Pluronic结合物催化反应的转化率仍然能达到80%以上。Wu等[13]研究了脂肪酶-Pluronic结合物在甲基叔丁基醚中催化外消旋化苯基甘氨酸甲酯的氨解反应、合成R-苯基甘氨酸酰胺的反应过程，结果发现，脂肪酶-Pluronic结合物的表观催化活性达到了天然酶的11倍。

但是，对于表面含有较少赖氨酸残基的酶分子，用醛基化的Pluronic共价修饰酶分子时的修饰反应效率较低，难以形成酶-Pluronic结合物。为解决此问题，Wu等[15]报道了在反胶束体系中合成酶-Pluronic结合物，以醛基化的Pluronic作为反应型表面活性剂，在反胶束限域空间中进行酶的高效修饰反应。这种方式可以有效提高赖氨酸较少的酶分子的修饰效率，如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)，合成的HRP-Pluronic结合物在有机相中的表观催化活性是天然酶的10倍。

2 酶-无机晶体复合物

无机晶体材料具有很好的结构刚性，可以提高包埋在其中的酶分子的结构稳定性，同时晶体中的金属离子等成分还有可能赋予固定化酶新的功能特性。然而，如何把酶分子包埋到无机晶体中是一个重要挑战。Ge等[9]报道了一种基于共沉淀过程将酶分子包埋到无机晶体中的方法：将CuSO4水溶液加入到含有酶分子的磷酸盐缓冲液中，蛋白分子诱导磷酸铜晶体形成并辅助其生长，在磷酸铜晶体生成沉淀的过程中，酶分子被包埋到磷酸铜晶体中，得到如图1所示的具有花状微纳结构的酶-无机晶体复合物。经研究最终发现：包埋在磷酸铜无机晶体中的漆酶催化活性是天然酶的5～7倍。同时，在室温水溶液环境下，60 d后，漆酶-磷酸铜晶体复合物的活性仍然保持95%以上，而天然酶在相同条件下会丧失50%以上的活性。该工作引起很多研究者对共沉淀方法构建酶-无机晶体复合物的兴趣，出现了很多类型酶-无机晶体复合物的制备研究工作[16-23]。Li等[24]采用该方法制备了辣根过氧化物酶(HRP)-葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)双酶共包埋的酶-磷酸铜无机晶体复合物，并通过反应流程控制使得GOx分布在复合物的外层，HRP分布于复合物的内部，结果发现：磷酸铜无机晶体共包埋提供的双酶邻近效应和区域化效应提高了双酶催化总活性，达到了天然酶的3倍。同时，在水溶液中常温保存7 d后，双酶-无机晶体复合物的总活性仍然可以保持90%以上，而天然双酶体系相同条件下在1 d后就丧失80%的活性。

图中右上角的插图是高分辨率扫描电镜照片，左上角为自然界中花在不同生长阶段的照片图1 不同的蛋白浓度下合成的蛋白-磷酸铜无机晶体复合物的扫描电镜照片Fig.1 SEM images of hybrid nanoflowers made from BSA-Cu3(PO4)2·3H2O under diffirent protein concentrations

Li等[25]在采用共沉淀法制备具有高催化活性和良好稳定性的脂肪酶-磷酸铜晶体复合物的基础上，通过原位还原的策略，制备了脂肪酶(CandidaAntarcticalipase B,CALB)-铜纳米颗粒复合物。在原位还原过程中，加入聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)可以有效保护酶的活性，得到的CALB@PVP@Cu复合物保持了82%的酶活。CALB@PVP@Cu复合物中的铜纳米颗粒相比于传统的纳米铜材料，具有粒径更小、比表面积更高的优点，可提高脂肪酶-铜级联催化反应的效率。

除磷酸铜晶体外，其他晶体材料如磷酸锌[26-27]、磷酸钴[28]和磷酸氢钙[29]等也被证实可以用于酶-无机晶体复合物的构建。Zhang等[27]制备了脂肪酶-磷酸锌复合物，其催化活性比天然酶提高147%。晶体包埋作用可很好地提高酶的稳定性，使固定化的酶能够更好地耐受pH、高温等条件，同时具有长期稳定性。

以蛋白复合物代替单一蛋白分子，同样能够起到诱导晶核形成、辅助结晶的作用。Ye等[29]利用刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)对糖蛋白先进行特异性结合，在此基础上进一步构建了Con A-转化酶-磷酸氢钙(ConA-invertase-CaHPO4)复合物，用于检测食品中的大肠杆菌O157：H7(EscherichiacoliO157：H7)。该方法的检测线性范围可以达到10～105CFU/mL，最低检测限为10 CFU/mL，检测精度比其他大肠杆菌检测方法提高了1～2个数量级。

此外，采用无机晶体材料作为固定化酶载体，除了能够提高酶的稳定性之外，还能为酶催化剂带来新的功能。例如，Li等[30]采用水溶液共沉淀法制备了酶-水胆矾晶体复合物(copper hydroxysulfate nanocrystals,CHNs)，对不同酶的效率有所不同，如：细胞色素c(Cyt c)-CHNs复合物在水溶液中的活性是天然酶的143倍，HRP-CHNs复合物的活性是天然酶的1.1倍。更为有趣的是，水胆矾晶体材料的引入使得复合物产生了抗菌功能，该复合物在水溶液中可以有效杀灭细菌，防止水相反应体系染菌。同时，作为一种具有自抗菌能力的生物催化剂，酶-水胆矾晶体复合物在工业生物催化中防止体系染菌、生物传感器中防止器件表面染菌等方面具有潜在应用价值。

3 酶-MOFs晶体复合物

金属-有机骨架化合物(metal-organic frameworks,MOFs)[31-32]是一类新型的多孔无机晶体材料，在气体储存[33-34]、催化剂[35]、吸附分离[36-38]以及蛋白功能构型变化机制研究[39-40]等方面都有着广泛应用。近年来，将MOFs应用于酶固定化也得到了研究者的广泛关注。多孔硅作为常用的固定化酶纳米材料，具有孔径大、孔隙率高、孔结构规则等特点。然而，由于其一维的孔道结构以及缺乏与酶的有效相互作用，会出现酶泄露与聚集的情况[41-44]；而MOFs可以通过有机组分与酶分子的相互作用有效地固定酶分子，因为MOFs具有更小的孔径，这也在一定程度上避免了酶分子的泄露与聚集。

采用MOFs进行酶固定化主要有以下3种不同的制备方法。第1种方法是先进行介孔MOFs材料的合成，再将酶分子直接吸附固定于MOFs孔道中[45-48]。Lykourinou等[45]将过氧化物酶(microperoxidase-11，MP-11)吸附固定化于由铽与2,4,6-三(4-羧基苯基)-1,3,5-三嗪构成的介孔MOFs(Tb-4,4′,4″-(1,3,5-trianze-2,4,6-triyl)tribenzoic acid，Tb-TATB)中，而Chen等[39]则研究了Cyt c吸附于Tb-TATB过程中酶分子的构象变化。Lian等[49]采用一种具有3种不同孔径结构的特殊MOFs材料PCN-888，通过分步包埋的方法来实现2种不同大小酶分子GOx和HRP的分区定点固定化，构建级联反应的纳米反应器。Li等[47]将有机磷水解酶(organophosphorus acid anhydrolase,OPAA)包埋于介孔MOFs材料PCN-128y中，包埋后的OPAA催化二异丙基氟磷酸(diisopropylfluorophosphate，DFP)水解的活性接近天然酶的20%，转化率达到80%～90%。OPAA@PCN-128y有很好的热稳定性和长期使用稳定性，在70 ℃下仍然能保持70%以上的活性；而在同样条件下，天然酶只能维持不到20%的活性；室温放置3 d，天然酶催化水解反应最高只能达到25%的转化率，而OPAA@PCN-128y催化反应能够达到90%的DFP转化率。

最近的研究中，Zhang等[50]报道了一种构建介孔MOFs用于酶的吸附固定化的新方法。先将聚苯乙烯(PS)纳米小球包埋到ZIF-8晶体中，再除去PS小球，从而构建介孔，介孔用于吸附酶分子进行固定化。采用该方法可以制备介孔-微孔复合ZIF-8(mesoZIF-8)，Cyt c分子可以被吸附于mesoZIF-8的介孔内部，mesoZIF-8的微孔可增强反应底物传质。相比于天然酶，所制备的Cyt c@mesoZIF-8的活性提高了128%，米氏常数Km降低了50%，应用于丝网印刷酶电极检测过氧化氢时，检测灵敏度提高了1.4倍。

第2种方法同样是先合成MOFs材料，然后再将酶分子吸附或者共价结合在MOFs的表面进行固定化。Jung等[51]将CALB通过共价结合的方法固定在一、二、三维结构MOFs材料表面，催化高立体选择性的酯交换反应。在有机溶剂中，三维MOFs材料表面结合的CALB催化活性是自由CALB的近1 000倍。同时，其催化酯交换反应的立体选择性也达到甚至超过了天然CALB的水平。酶在MOFs表面的固定化研究也引起了其他研究者的关注[52-56]。Xia等[56]在氨基功能化修饰的MOFs材料UiO-66-NH2表面利用谷氨酸锌与磁性纳米颗粒修饰，合成了特殊的金属-生物分子网络，并在其表面吸附黑曲霉脂肪酶(Aspergilllusnigerlipase，ANL)，酶负载量为118.0 mg/g，保持了天然酶82%的活性。该固定化脂肪酶在广泛的pH与温度范围内具有很好的可操作性，并且可以通过磁场方便地对催化剂进行回收和重复使用。

上述2种制备酶-MOFs复合物的方法也还存在一些问题。例如，制备过程相对较复杂，需要先合成一些特殊的具有较大孔径或表面官能化的MOFs材料，或者酶分子和MOFs载体结合不够牢固，酶分子仍然易从MOFs载体上脱落。

第3种方法是共沉淀法制备酶-MOFs复合物。受到酶-无机晶体复合物研究的启发，Lyu等[10]提出采用共沉淀法将酶直接包埋于ZIFs内(图2)，将2-甲基咪唑与含有酶的水溶液混合，再加入到锌盐水溶液中，在Zn2+与2-甲基咪唑自组装形成ZIF-8的过程中，酶分子会与该结构发生共沉淀，形成酶-ZIF-8晶体复合物。包埋后的Cyt c的活性是天然酶的10倍，米氏常数Km也由天然酶蛋白的15 mmol/L降至2 mmol/L。ZIF-8包埋的酶分子对有机溶剂有很好的耐受能力，在甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜等蛋白变性溶剂中，天然酶基本完全丧失活性，而包埋在ZIF-8中的酶分子能够保持催化活性不变[58]。该共沉淀方法制备酶-MOFs复合物具有简便、高效且能够适用于不同种酶体系的特点[59]，是一种有效提高酶稳定性的固定化方法。共沉淀法由于其简单和较为通用的特点受到研究者的关注，采用该方法，Liang等[60]、Shieh等[61]、Li等[62]、He等[63]和Cui等[64]分别探索了辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、病毒衣壳蛋白和脂肪酶等在ZIF-8晶体中的包埋，进一步证实该方法可以很好地提高多种酶体系在高温、有机溶剂和宽泛pH范围等容易导致酶失活环境下的稳定性。

图2 采用共沉淀法制备Cytc-ZIF-8晶体复合物[10]Fig.2 Protein molecules directly embedded in metal-organic frameworks by a coprecipitation method

在进一步研究中，Wu等[65]报道了采用共沉淀法制备双酶-MOFs晶体复合物，在ZIF-8中同时包埋葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)，合成了GOx&HRP-ZIF-8复合物，探索MOFs晶体中的双酶级联催化机制，结果发现：基于ZIF-8晶体中双酶邻近效应，中间产物过氧化氢易扩散到HRP附近被催化，GOx&HRP-ZIF-8复合物的催化总活性为GOx-ZIF-8复合物与HRP-ZIF-8复合物混合体系的2倍。同时，双酶-MOFs晶体复合物的稳定性提高，在常温水溶液中放置7 d，复合物的活性仍然能保持80%，而在相同条件下，天然双酶体系的活性低于初始酶活的50%。

为了进一步提高酶-MOFs晶体复合物的重复使用性能，Wu等[66]利用聚多巴胺(polydopamine,PDA)将酶-MOFs晶体复合物进行共价交联，形成微米级的PDA@GOx-ZIF-8复合物。经研究发现：复合物保持了50%的酶活，并且可以更为便捷地通过离心对酶催化剂进行分离和重复使用；经过10次重复使用，复合物的活性保持不变。

在溶液中一步共沉淀法制备蛋白-MOFs复合物研究的基础上，Hou等[67]采用市售彩色喷墨打印机在多种可打印介质(如纸张等)上实现了蛋白质-MOFs复合物的原位图案化合成。基于共沉淀法的原理，该工作将蛋白质溶液、合成MOFs所需的金属离子溶液和有机配体溶液分别装入喷墨打印机的不同墨盒中，通过设计打印图案和配色，可以对打印位置和比例进行精确控制。在可打印介质表面上，发生蛋白溶液和合成MOFs前驱体溶液的微液滴融合，在液滴中形成蛋白质-MOFs复合物，并固载在介质表面。在生物传感器、生物电子器件等很多生物医学工程应用中，通常需要在材料表面上进行生物大分子的图案化固定，喷墨打印原位构建蛋白质-MOFs复合物的方法为介质表面上生物大分子的图案化固定提供了新策略，有望推动其在生物传感器、可穿戴生物电子器件、人造仿生膜和组织工程等领域的进一步深入研究。

4 结论与展望

酶固定化是提高酶催化剂重复使用次数、增强酶稳定性的有效手段，但是传统的固定化方法经常会带来较大的酶活损失，使得固定化酶的表观活性远低于天然酶，并且固定化方法适用范围有限，难以用于多酶体系的可控固定化。开发新型的固定化载体材料和方法，利用简便、通用和易规模化制备的方法进行酶固定化，同时兼顾固定化酶的表观活性和稳定性是该领域研究者追求的目标。

本文中，笔者总结了近年来在利用功能高分子修饰酶、共沉淀法制备酶-无机晶体复合物方面的一些工作。采用功能高分子(Pluronic)修饰能够显著提高酶在有机溶剂中的表观催化活性，同时方便酶催化剂的重复使用；采用共沉淀法可以简便合成多种酶-无机晶体/MOFs晶体复合物，在获得很好的酶稳定性的同时兼顾酶的表观活性，并且该方法可以实现双酶的可控共固定化，提高双酶催化总效率。新型酶固定化或酶修饰材料的研究为提高酶在实际应用中的性能提供了丰富的可能，为高效酶催化剂的设计和可控制备提供了新的解决方案，通过纳米技术、材料科学和生物技术的最新发展推动生物化工研究的进步。未来，在面向实际应用体系的酶-纳米材料界面问题研究、固定化载体上酶分子结构的清晰表征和控制、新型固定化酶规模化制备技术等方面的深入探索将进一步推进该领域的快速发展，为绿色化工过程、高效检测体系提供稳定、高活性和丰富功能性的酶催化剂。

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