无细胞蛋白质合成的研究进展

张 鹏，林 骏，卢 元

(1. 清华大学 化学工程系，北京 100084； 2. 中国石油大学(北京) 新能源研究院，北京 102249)

生物技术的进步使得合成生物学家可快速可靠地改造生物体系及设计生产生物大分子，尤其是具备生物学功能的蛋白质大分子的设计生产。在过去多年合成生物学的发展中，主要以细胞为宿主对蛋白质进行工程化设计,但是在细胞内部进行工程化是费时和困难的。主要原因在于细胞的生长及适应性过程通常与工程设计目标是不一致的，并且由于活细胞生命系统的复杂性、基因元件难以标准化、细胞膜的阻碍等，这大大限制了生物组件的改造[1]。这些限制使人们试图探索新的发展方向，因而推动发展了一项新的工程技术——无细胞合成生物学。探究历史，最初无细胞合成的雏形和代表性工作要追溯到1961年，Nirenberg和Matthaei用无细胞合成进行创新性实验，在发现遗传密码子方面发挥了重要作用[2]。而现在，无细胞合成生物学的发展使得其在蛋白质合成中显示出巨大的作用，包括合成细胞难以表达的膜蛋白、制造高附加值的生物医药蛋白、非天然元件的嵌入以及高通量筛选等[3]。

无细胞蛋白合成系统是以外源DNA或mRNA为模板，在体系中补充底物和能量物质，在细胞抽提物提供的多种酶的作用下合成蛋白质的体外表达系统(图1)。细胞抽提物可以来自不同种类的细胞，主要包括大肠杆菌[4]、小麦胚芽细胞[5]、兔网织红细胞[6]和昆虫细胞[7]等。要特别强调的是，另一类以纯化组分为基础的无细胞蛋白质合成系统不在此讨论范围内。无细胞蛋白合成系统以DNA或mRNA为模板，提供了灵活多变的蛋白表达方式。与传统的细胞体内表达系统相比，无细胞蛋白合成系统具有众多优点：因没有细胞膜的阻隔，外源性的物质可以直接加入到反应体系中，从而对反应条件进行针对性的调控，例如促进蛋白的折叠或进行翻译后修饰[8]；因不存在活细胞，该体系可用于表达在胞内系统中难以表达的蛋白质，如对细胞有毒害作用的抗菌肽[9]和离子通道蛋白[10]等，同时表达过程也不受细胞生长代谢的影响；由于其开放性的特点，无细胞蛋白质合成系统能够与其他的高通量手段或工具相耦联，开发新型的高通量复合研究手段。最后，无细胞形式允许进行筛选而不需要基因克隆步骤，从而实现快速的工艺/产品开发[11]。

图1 无细胞蛋白质合成系统Fig.1 Cell-free protein synthesis systems

尽管无细胞系统相比细胞系统有诸多优势，但在发展初期，几个障碍因素限制了它们在蛋白质工程及生产技术领域的使用。这些障碍因素包括反应持续时间短、蛋白质生产率低、模板不稳定及易降解等。此外，还有昂贵的试剂成本、反应量小以及复杂蛋白质的合成较为困难等因素。然而，过去十几年的技术进步已经解决了这些局限性，并重新优化了无细胞蛋白质合成系统，以满足日益增长的蛋白质合成需求。

在本文中，笔者首先介绍不同的无细胞蛋白质合成系统，接着讲述无细胞合成蛋白质系统的技术发展，最后重点介绍无细胞蛋白质合成系统的前沿应用。

1 无细胞蛋白质合成系统简介

无细胞蛋白质合成系统利用了微生物、植物或动物细胞裂解物中的能量和蛋白质合成所必需的催化成分来生产目的蛋白质。虽然任何生物体都可以提供裂解物，但最常见的无细胞蛋白质合成系统的裂解物是大肠杆菌、小麦胚芽、兔网织红细胞和昆虫细胞的抽提物。这些细胞本身的特性不同，从它们中得到的提取物必然也是不同的。因此，使用无细胞蛋白合成系统生产生物活性蛋白质首先要选择合适的提取物来源。表1总结了不同来源提取物的无细胞合成系统，并进行了比较。

由表1可见：最常用的是原核大肠杆菌提取物系统。因为第一，大肠杆菌可以使用廉价培养基培养，直接高压破碎进行细胞裂解，提取物的制备简单且便宜；第二，大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统在间歇反应中能得到最高的蛋白质产量，从数百微克/毫升到毫克/毫升，这取决于目的蛋白质的种类。第三，大肠杆菌提取物系统的反应成本最低。因为它能够激活提取物中的代谢反应，从而促进高水平的蛋白质合成，避免使用昂贵的能量底物[3]。

小麦胚芽、兔网织红细胞和昆虫细胞提取物系统也是常用的真核无细胞蛋白质合成系统。与原核大肠杆菌系统相比，这些真核提取物系统在生产某些复杂蛋白质方面具有优势，可以实现翻译后修饰[4]。然而，真核无细胞蛋白质合成系统提取物制备程序复杂且昂贵，在间歇反应中蛋白质产量低。

迄今为止,尽管开发的每个无细胞蛋白质合成系统都具有优点，但必须仔细考虑产量、成本和翻译后修饰之间的权衡，从而进行系统的选择。

表1 不同无细胞蛋白质合成系统的比较

2 无细胞蛋白质合成系统的发展

无细胞蛋白质合成要达到最大产量必须满足一些要求，包括足够的底物供应、稳态环境以及没有抑制性副产物产生。这和生长快速的完整细胞的体内状态特征一致。因此，优化无细胞蛋白质合成系统的指导原则是通过在体外模拟细胞质高效的系统来激活生物学过程。而无细胞蛋白合成系统的发展与基因表达模板、代谢调控、蛋白质折叠及工程化研究等进展相关联。

2.1 基因表达模板

在无细胞蛋白质合成系统中，基因模板的稳定性是制约系统效率提高的一个关键因素。在常规的无细胞蛋白质表达过程中，一般使用质粒为模板，以提高整个系统的稳定性以及目标蛋白质的产率。然而，使用质粒为模板必须进行分子克隆、转化以及宿主菌培养、质粒纯化等繁琐步骤。该方式仅适合于研究单个或者少数几个基因的体外表达情况，对于要求高通量筛选的研究，如蛋白质组学研究或蛋白质分子的定向进化研究等，以质粒为模板的表达方式则有效率低的问题。

以线性多聚酶链式反应(PCR)产物作为模板，直接由快速PCR反应扩增得到目的基因，可避免质粒转化、宿主菌培养等步骤，简化了无细胞蛋白质合成的前期准备工作，具有极好的高通量潜力。然而，与质粒模板相比，线性模板更脆弱，极易受到提取物中核酸酶的攻击而迅速被降解，从而导致表达的目标蛋白质的产率极低，且对目标蛋白质功能检测有很大的影响。因此，基因表达模板初期的研究重心放在对菌株的基因改造上。Ahn等[12]采用敲除了编码核酸内切酶E基因的菌株制备无细胞抽提物，这样大大增加了DNA模板的稳定性。除了对菌株进行基因改造以营造一个缺失核酸酶的无细胞反应环境外，调整模板自身结构以抵御外界核酸酶攻击则可能是一种更为有效的方法。Wu等[13]通过设计特殊引物最终将线性片段形成了类似于质粒的环形DNA分子，提高了目的基因片段对核酸外切酶的抵御能力。

通过提高局部有效模板浓度是提高无细胞蛋白质合成产量的另一种方法。Park等[14]将线性模板DNA分子与X形DNA衔接以产生用于组合的无细胞转录和翻译系统的DNA水凝胶。与可溶性DNA模板对照相比，在小麦胚芽无细胞系统中，该方法使得蛋白质产量提高了300倍。这是因为对内源性DNA酶消化的基因进行保护，可通过降低DNA溶解度以产生更高的总基因浓度，同时由于基因的局限定位产生更快的酶周转率，从而提高了蛋白质产量。

2.2 代谢调控

1999年开始，Kim和Swartz课题组进行的一系列实验揭示了代谢网络[15-17]。他们的实验结果表明：可以将蛋白质合成转化为可分析和控制的生化反应，推动了无细胞蛋白质合成的发展。实现细胞质模拟对高活性无细胞系统是至关重要的，因为它能够减轻无细胞蛋白质合成系统受到的基质限制，从而提高产量。近年来，通过改变提取物制备方法得到更好的提取物，这些技术激活了无细胞合成蛋白质的中枢代谢，扩大了反应规模。最近对大肠杆菌提取物制备方法中的每个步骤都进行了系统优化。例如，开发了新的培养基用于源细胞的持续生长[18]，通过高密度发酵来生产提取物[19]，同时制备方法的简化可减少时间和成本。优化提取物制备方法有利于无细胞蛋白质合成反应的放大。

激活细胞提取物中蛋白质合成能力是非常重要的。通过刺激中枢代谢来给高水平无细胞蛋白质合成供应能量，而不是由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等昂贵的化合物来供应能量。Jewett等[20]研究在反应中激活中枢代谢，氧化磷酸化和蛋白质合成，为蛋白质合成提供能量(在2 h内达到1.2 mg/mL)。除了激活有益的途径，还可以除去有害的途径。例如，通过删除编码有害酶的基因使氨基酸底物稳定化，实现高水平的无细胞蛋白质合成[3,21-22]。

2.3 蛋白质折叠

在过去十几年中，研究者试图高效合成复杂蛋白质，但蛋白质的功能与它能否正确折叠有关。为了折叠复杂的蛋白质，无细胞系统必须将靶蛋白的疏水区域彼此屏蔽，提供适宜的天然化学环境，并加入辅助因子如铁-硫簇，促进二硫键的形成和异构化。无细胞蛋白质合成系统的一个主要困难是复制体内氧化折叠途径，促进二硫键的形成和异构化[23]。生物系统使用不同的区域将蛋白质合成与氧化折叠分开，无细胞系统希望在一个空间中完成这两项任务。尽管困难重重，但在含有多个二硫键的真核蛋白的折叠方面已经取得了相当大的进展。Swartz及其同事研究发现，可以通过平衡氧化还原电位在无细胞蛋白质合成反应中建立氧化环境，促进二硫键形成。他们通过使用碘乙酰胺预处理细胞提取物，使用谷胱甘肽缓冲液提供氧化环境，并提供形成二硫键的蛋白质DsbC，成功合成了活性尿激酶[24]和截短形式的组织纤溶酶原激活物[23]。

为了形成和异构化二硫键，帮助新生多肽达到其活性构象而不聚集，也可以利用多种酶。添加这些酶分子对体外生产蛋白质是至关重要的。除天然折叠物之外，还可使用一些合成的物质。Welsh等[25]将真核Hsp70伴侣BiP与触发因子系在一起，结果发现，真核生物分泌的蛋白质中可溶性蛋白质产量得到改善。Sasaki等[26]通过将两亲性多糖纳米凝胶掺入无细胞反应来改善蛋白质折叠，允许肽链的结合然后控制释放，防止一些蛋白质的聚集和错误折叠。这些例子展示了通过直接添加新组件来调整无细胞系统组件的设计自由度。

2.4 工程化研究

专注于底物可用性引起技术开发的重大转变。例如，使用连续交换或双层系统，被动扩散能够补充基质并除去副产物。封闭的批次系统使所提供能量基质得到有效利用，且易于放大以及许多蛋白质的平行表达。另外，连续进料可以大大延长系统的反应寿命和蛋白质产量[27]。

冷冻干燥技术的发展也推动了无细胞蛋白质合成系统的发展，运用冷冻干燥技术，将配好的无细胞体系与基因模板分别冷冻干燥，当需要它们反应时，只需将它们混合在一起，加水活化即可，它们之间就能发生反应合成蛋白质。通常，冷冻干燥能使它们的活性在室温下保持一年[28]。结合活化有效能量代谢的进展，支持长寿命蛋白质生产与新的提取物制备方法，Zawada等[29]开发了一种大型大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统，他们开发的无细胞合成系统能够在100 L的规模下10 h内产生700 mg/L的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)。这种技术使蛋白质药物的商业化生产成为可能。

3 前沿应用

3.1 基因电路开发

模块化基因电路的开发是合成生物学家工具箱中的重要工具，因为它允许快速组装和控制新颖的复杂网络。在体内基因电路方面已经取得了进展。然而，体外方法提供了更加独特的优点，包括：反应环境的控制和可预测性；允许加速原型设计；更易对反应电路进行真正模块化。一个应用例子是加速原型循环设计开发，允许在8 h内对4组分遗传开关进行原型设计[30]。

利用无细胞系统设计原型周期的快速性，已经设计了许多无细胞电路，如逻辑门[31]、存储元件[32]和振荡器[33]。这些无细胞遗传电路的应用是简化人工细胞和细胞样微器件的工程设计。一个应用例子是在33 fL～16 pL的微乳液滴中振荡器的演示[34]。在每个微乳液中，通过初始试剂浓度的变化产生丰富多样的反应群体。这种诱导的变异性可以用于以超高通量方式产生大数据集，用于表征非线性生化网络和电路行为的参数估计。

3.2 膜蛋白

膜蛋白合成是另一个非常受到重视的应用。据报道，膜蛋白占所有潜在药物靶标的3/4[35]。然而，由于其复杂的结构、疏水跨膜区域、对宿主的毒性、所需的耗时长且低效率的折叠步骤，使得它们在体内大量表达难以实现。现在证据表明使用无细胞蛋白质合成系统可以生产用于生物化学或结构研究的高水平表达膜蛋白，现将成功的例子总结于表2中。使用无细胞蛋白质系统合成膜蛋白的关键思路是在有助于溶解膜蛋白质的脂质或去污剂的存在下合成膜蛋白。例如，直接添加表面活性剂或纯化的脂质可以防止膜蛋白多肽的聚集[41]；也可以用纯化的大肠杆菌磷脂双层囊泡来代替表面活性剂，使用这种方法，成功表达了两种膜蛋白——四环素泵(TetA)和甘露醇通透酶(MtlA)，分别获得了高达570 μg/mL和130 μg/mL的产量，产量是细胞表达方法的400倍[42]。

Noireaux等[43]利用磷脂囊泡封闭无细胞蛋白质合成反应，通过表达孔形成蛋白α-溶血素，蛋白质能够成功整合到磷脂双层中并形成小分子选择性渗透通道。该技术也可应用于进一步探究膜蛋白和磷脂双层的相互作用。

表2 无细胞蛋白质系统用于膜蛋白的合成

3.3 生物医药蛋白

由于成本、工业放大和蛋白质折叠不再是无细胞技术不可逾越的障碍，因此可以利用无细胞蛋白质合成进行商业化生物医药蛋白的生产。首先，无细胞蛋白质合成系统可以用于抗体的生产。例如，在生产HER2抗体和抗体片段时，加入分子伴侣(酵母和大肠杆菌蛋白二硫键异构酶)以促进原核无细胞系统产生大量的活性蛋白质，产量高达300 mg/L[44]。

其次，无细胞蛋白质合成系统还可以用来合成疫苗。无细胞合成系统的主要优点是易于调整DNA模板浓度来优化反应，调整产物稳定性和控制氧化还原电位来优化二硫键的形成。这一控制使得研究人员能够快速产生淋巴瘤个性化疫苗[7]。无细胞合成系统的另一个优点是能够大量表达毒性蛋白质。这可以改善疫苗的开发能力，特别是在疟疾研究方面。因为在研究疟疾时，发现相关的蛋白质基因中A/T含量高，所以无法在生物体内产生足够的蛋白质用于相关研究。例如，在大肠杆菌细胞中重组表达108个疟疾蛋白，但是仅有60%能够成功生产[45]。疫苗在体内生产的另一个挑战是易产生错误的糖基化免疫原性蛋白，这可能促进不正确的免疫应答。Tsuboi等[45]使用小麦胚芽无细胞系统表达了478种疟疾蛋白质，避免了蛋白质的糖基化，因为此无细胞系统中没有糖基化酶。Doolan等[46]使用了一种补充含有稀有tRNA的大肠杆菌无细胞系统，以促进A/T丰富区的翻译，成功表达了250种疟疾相关蛋白，效率高于90%。因此，利用这些无细胞合成系统能够产生快速疫苗筛选所必需的蛋白质。

最后，无细胞蛋白质合成系统可用于类病毒颗粒的合成[45]。类病毒颗粒的合成也是疫苗领域非常受人关注的，它是一种或多种结构蛋白质的自组装复合物，尺寸为25～100 nm，在结构上与病毒相似，它能引起免疫原性反应，但不含有遗传物质，也没有感染性，同时，病毒样颗粒的多价特性增加了免疫原性，因此有多种功能。虽然在生物体内生产病毒样颗粒已经进行了许多年，但仍然存在不能有效生产的问题，例如在生物体内时，会出现细胞毒性和对单体蛋白过度表达的控制[47]。然而使用无细胞合成系统，可以快速优化且稳定生产的病毒样颗粒。例如，用于疫苗开发的无细胞合成应用是将非天然氨基酸掺入细菌鞭毛蛋白中，随后将其固定在病毒样颗粒上。当辅因子和相关试剂被快速优化后，鞭毛蛋白的产量从263 μg/mL增加到336.3 μg/mL。与游离鞭毛蛋白相比，病毒样颗粒固定的鞭毛蛋白的生物活性提高了10倍，为新一代超级疫苗奠定了基础[48]。

3.4 非天然氨基酸

非天然氨基酸嵌入是一个强大的合成生物学工具，它会导致独特的化学基团嵌入蛋白质。该技术具有许多应用前景，如配体-蛋白质相互作用、生物治疗和生物催化等[49]。

非天然氨基酸嵌入有两种主要的方法。一种是全局抑制，利用天然翻译机器将非天然氨基酸嵌入蛋白质；另一种是最常用的琥珀抑制，利用琥珀终止密码子，依赖于正交的突变氨酰tRNA合成酶/tRNA配对，将非天然氨基酸嵌入蛋白质。无细胞合成系统已成功应用于这两种方法，并且非常容易地通过优化非天然氨基酸的浓度以避免非天然氨基酸嵌入的低效率瓶颈[49]。在无细胞合成系统中，还可通过优化氨酰tRNA合成酶/tRNA配对、反应条件的实时测定等来提高嵌入效率。另一种无细胞合成改善非天然氨基酸嵌入的方法是控制正交tRNA(otRNA)含量[50]，这种共表达是通过提供更高浓度的otRNA来提高产量，同时避免otRNA表达和纯化之前成本昂贵的步骤。

3.5 高通量分析

在后基因组时代，高通量蛋白质表达平台变得越来越重要。无细胞蛋白质合成系统的很多优点可以满足这一需求。第一，直接使用PCR模板，可避免时间长及操作繁琐的分子克隆步骤；第二，经济高效的高产量分批反应，使多孔(96或384孔)蛋白质生产成为可行；第三，使用小型化和自动化的微芯片，使其具有巨大的应用潜力；第四，没有细胞壁屏障，使得反应条件易被操纵，包括向系统掺入同位素标记的氨基酸来跟踪反应。

在无细胞蛋白质合成系统中，可利用核磁共振(NMR)技术分析同位素标记的蛋白质结构或用X线晶体学来研究相关蛋白，这些工作在结构生物学的研究中起着至关重要的作用。无细胞蛋白质合成系统的一个主要优点是高的氨基酸嵌入效率及高蛋白表达产率。另外，在无细胞蛋白质合成系统中表达的产物无需纯化，可以直接进行核磁共振分析，目前已经使用无细胞系统确定了数千种蛋白质结构。

无细胞蛋白质合成平台也可作为大规模合成功能基因组学蛋白质文库的基础技术平台。例如，使用无细胞蛋白质合成系统可以快速有效地产生蛋白原位阵列(PISA)，以全面研究微芯片上的蛋白质相互作用网络[51-52]。小麦胚芽无细胞合成系统被称为“人类蛋白质工厂”，试图用来合成13 364个人类蛋白质。在合成的蛋白质(12 996个或总数的97.2%)中，许多蛋白质经测试后显示了其特有的功能(例如75个测试的磷酸酶中的58个都有活性)，并且成功地将99.86%的蛋白质印刷到载玻片上构建成蛋白质微阵列[53]。因为无细胞蛋白合成系统在合成时，无需将蛋白质合成、纯化和固定的步骤分开进行，所以这样可更快地来探测蛋白质的不同方面的功能。另外，结合功能化碳纳米管材料，则降低蛋白质的检测限[54]。除了蛋白质阵列之外，其他功能基因组学方法，如序列蛋白表达等，有望帮助揭示每一种基因所对应的蛋白质产物的功能。

4 结语与展望

无细胞蛋白质合成系统作为一个强大的技术平台，可以解决细胞表达系统难以解决的问题。无细胞蛋白质合成系统独特的开放性，使得它能够对基因表达、底物优化和原位监测等达到精确控制，从而实现蛋白质合成的精确且个性化的工程设计。此外，随着无细胞蛋白质合成系统成本的降低、效率的提高及工业放大化的逐步实现，使得无细胞合成系统不仅仅可以作为基础研究工具，也可以作为良好的工业化生产平台。将来，无细胞蛋白质合成系统的发展，需要进一步降低成本、提高效率，需要实现更好的蛋白质翻译后修饰，同时提高系统的稳定性。此外，为了进一步拓展无细胞合成系统的应用范围，需要和材料学、自动化和生物医学等学科进行更进一步的融合。

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