Surfactin的生产及在石油工业的应用研究进展

杨子云，马科锋，何禹锟，龙旭伟

(南京理工大学 环境与生物工程学院，江苏 南京 210094)

生物表面活性剂(biosurfactants，BS)是由细菌或真菌分泌的具有表面活性的胞外次级代谢产物。BS分子由一个或多个亲水性和疏水性基团组成，亲水基可以是酯、羟基、肽、磷酸盐或者是糖基；疏水基可以是饱和或非饱和脂肪醇及脂肪酸链等[1]。生物表面活性剂独特的两亲性分子结构使其能在两相界面定向排列形成分子层，从而降低界面能。生物表面活性剂具有良好的分散、增溶和润湿等功能，在食品、农业、日化、环保和医药等领域[2]具有广泛的应用前景。值得一提的是，由于具有良好的环境友好特性，生物表面活性剂近年来在石油化工行业上的应用研究越来越受到关注，例如：可用于原油开采、石油回收和污染土壤的生物修复等。

表面活性素(surfactin)是研究报道较多、也是最具潜力的生物表面活性剂之一。Surfactin是在1968年由Arima等[3]用肉汤培养枯草芽孢杆菌BacillussubtillsIFO 3039时首次发现。Surfactin最初被用作纤维蛋白凝集抑制剂，后被发现能溶解红细胞，且可以显著降低水的表面张力，是表面活性最为优异的生物表面活性剂之一[4]。Surfactin具有生物相容性、生物降解性、低毒性和超强的表/界面活性等优点，在石油开采、环境治理、医药、食品工业和化妆品等领域具有非常良好的应用前景[5]，尤其是在石油化工领域。但目前为止，surfactin尚无法用于实际的工业中，究其根本在于surfactin发酵生产水平低下，应用时的成本无法与化学表面活性剂进行竞争。

本文中，笔者首先对surfactin的结构性质和近年来的发酵工艺进行综述，然后对其近年来的应用研究，尤其是在石油化工领域内的研究进行归纳总结，并对surfactin未来的研究进行展望，旨在促进surfactin的工业化应用。

1 Surfactin的结构与理化性质

Surfactin是一种环脂肽类生物表面活性剂，由含7个氨基酸残基的肽环与含13～16个碳的β-羟基脂肪酸以内酯键结合而成(图1)[6]。由于脂肪酸链长度和氨基酸种类、位置的不同，surfactin具有多种同系物和异构体。依据其疏水结构中脂肪酸的链长差异，surfactin主要由C13、C14、C15及C16这4种同系物构成[7]。其中，C15 surfactin(即surfactin C)具有更高的表面活性和生物活性[8-9]。因此，现有的部分研究在提高surfactin产量的同时也关注如何提高surfactin C组分的比例。

图1 Surfactin A,B,C,D的结构Fig.1 Structure of surfactin A,B,C,D

Surfactin具有卓越的表/界面活性，当其浓度低至20 μmol/L时，即可将水的表面张力降低至27 mN/m。Surfactin在水中的临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)为23 mg/L[10]，远低于大多数表面活性剂，表现出更加优越的表面活性。同时，surfactin有良好的耐盐特性，可在盐度高达21%的环境中仍保持活性；它还具有良好的热稳定性，在121 ℃高温处理2 h后表面活性和乳化能力仍然保持稳定[11]。此外，surfactin还表现出溶血、抗菌、抗病毒及抗支原体等活性，可用作抗生素[12]。

2 Surfactin的发酵生产及影响因素

Surfactin的发酵产量较低，极大地制约了它的产业化生产。早期文献报道的surfactin产量普遍在0.1～0.8 g/L之间[13]，如此低的产量远无法满足工业化生产的要求。为了提高surfactin的产量，研究者们在优化菌株类型、发酵条件(温度、pH、接种量、转速等)、发酵培养基(碳源、氮源、微量元素等)和发酵工艺等方面进行了大量工作。

2.1 Surfactin的发酵菌株

Surfactin主要由芽孢杆菌属细菌发酵产生，其中枯草芽孢杆菌是生产surfactin能力最强的微生物。一般而言，产surfactin的枯草芽孢杆菌菌株大多来自于石油或烃类污染的土壤，表1归纳了近些年来报道的产surfactin的相关高产野生菌株。

从表1可以看出，不同菌株的surfactin产量具有显著差异。尽管发酵工艺参数对产量的影响不可忽略，但菌株自身产surfactin的能力差异也较为明显。例如，Willenbacher等[15]采用批次发酵结合泡沫分离技术对6株Bacillussubtillis的产surfactin能力进行了分析，发现DSM 10T的surfactin产量可达3.99 g/L，约为其他菌株的2倍。因此，为了提高surfactin产量，研究者们构建了高产的突变菌株和重组体菌株。Mulligan等[22]借助紫外诱变手段对B.subtillis进行诱变，surfactin产量比野生菌株提高2倍以上。Ohno等[23]将包含Ipa-14基因的质粒导入B.subtillisMI 113中构建重组体菌株，通过固态发酵(solid state fermentation,SSF)生产surfactin，其surfactin的产量比野生菌株提高了约7倍。离子束注入法(ion beam implantation)也被应用于突变B.subtillis以获得更高的surfactin产量[24-25]。例如：Gong等[25]利用离子束注入法得到高产突变菌株B.subtillisE8，采用配有泡沫回收装置的改良反应器发酵生产surfactin，其产量可达10.26 g/L，显著高于相同发酵工艺下的野生菌株。

表1 不同菌株的surfactin产量

2.2 发酵条件和发酵培养基的影响

2.2.1 发酵条件的影响

枯草芽孢杆菌发酵生产surfactin的过程中，pH、温度和溶氧量都会影响细胞的生长，从而影响surfactin的产量。为了获得较高的surfactin产量，大量研究者对B.subtillis发酵生产surfactin的相关参数进行了优化。

一般而言，B.subtillis生产surfactin的较适宜温度为25～37 ℃[26-27]，这与surfactin合成过程的酶有关。Surfactin的合成受非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthases,NRPSs)调控[28]，其合成酶复合体主要由4个酶亚基组成，分别是SrfA、SrfB、SrfC和SrfD，其中SrfD在surfactin合成的初始阶段至关重要[29]。上述酶活均受温度影响，因而温度会影响到surfactin的产量及组成成分。

表2列出了发酵转速和pH对surfactin产量的影响。由表2可知：pH[7,26]和溶解氧也在很大程度上会影响surfactin产量。Cosby等[33]报道，pH接近中性时，surfactin产量比其他pH条件下高出许多，这主要是由于Srf的表达是pH依赖性诱导，在pH为5.0或更低时，Srf表达非常低；提高pH至接近中性，可促进Srf的表达并大幅提高surfactin的产量。此外，surfactin的生产是好氧过程，B.subtillis对氧的需求较高，因此，提高发酵过程中的转速也有利于提高surfactin的产量。一般而言，搅拌转速越高，溶氧越好，surfactin的产量也越高；但转速过高时，较大的剪切力会对细胞造成伤害，从而不利菌体生长和surfactin的合成。

表2 发酵转速和pH对surfactin的产量影响

2.2.2 发酵培养基的影响

培养基优化是目前研究最多、也是工业发酵过程中用于提高产量最为普遍的应用手段之一。B.subtilis生产surfactin的发酵培养基优化研究集中在碳源、氮源和微量元素上，这些成分是维持枯草芽孢杆菌代谢的物质基础，同时也影响着surfactin的产量和种类。现有的研究大多是基于合成培养基的，且多以葡萄糖为碳源。Surfactin的发酵过程中，葡萄糖质量浓度一般在20～40 g/L，因为过高的葡萄糖浓度会导致培养基的pH过低，从而影响surfactin的合成[26]。此外，为了降低surfactin的发酵成本，农业副产品和食品加工废水等废弃物都被用来作为碳源代替葡萄糖，如腰果果汁、木薯粉和乳清蛋白等[34-35]。

氮源是B.subtillis生长代谢的必需营养因子，且氮源代谢过程与surfactin的合成密切相关。朱玲燕等[36]发现NH4NO3为发酵培养的最佳氮源，且质量浓度为2 g/L时surfactin产量最高。Willenbacher等[17]在培养基中添加50 mmol的(NH4)2SO4作为氮源，使surfactin产量从0.7 g/L提升至1.1 g/L。

微量金属离子是B.subtillis新陈代谢和surfactin生物合成过程中关键酶活性调节所必需的因子。Wei等[37]研究发现Fe2+的添加可以维持培养基的pH在一个稳定的范围，使surfactin产量从0.1 g/L提高到3 g/L。Mn2+也会影响B.subtillis对氮源的吸收和K+的摄取，添加0.01 mmol/L的Mn2+可以使surfactin的产量从0.33 g/L提高至2.6 g/L[38]。另外，Mg2+和K+的添加也会促进surfactin的产生，Mg2+是Sfp蛋白的辅助因子，能激活B.subtilisSfp蛋白合成从而提高surfactin的产量，而K+可促进surfactin合成后的分泌[39-40]。

2.3 发酵工艺的影响

B.subtilis生产surfactin的发酵工艺按加料方式可以分为批次发酵(batch culture)和流加发酵(fed-batch culture)，按发酵载体可以分为液体发酵(submerged fermentation，SMF)和固体发酵(SSF)。另外，共发酵法和半连续发酵法也逐渐被开发用于surfactin的发酵。其中，流加发酵是以批次发酵为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法，可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率，且可避免培养基有毒代谢物的积累，因此受到广泛关注。Sivapathasekaran等[41]采用动态的流加速率(3.7～10 mL/min)流加葡萄糖发酵生产表面活性剂，结果发现：该流加策略可使表面活性剂产量达6.2 g/L，比批次发酵提升了35%。

Surfactin系生物表面活性剂，在高通气搅拌下，不可避免地会产生大量的泡沫。这些泡沫不仅影响传质效率，而且会造成逃液和增加染菌风险，从而使发酵异常甚至失败。为了减少或避免泡沫的产生，研究者们提出固定化发酵和固态发酵工艺。Yeh等[26]在B.subtilisATCC 21332发酵液中加入少量固体多孔材料(如：活性炭或黏土)生产surfactin，结果发现：在培养基中加入25 g/L的活性炭后，surfactin产量达到3.6 g/L，比无载体的液体发酵提高了近36倍。He等[42]利用废酒糟谷物作为碳源，采用共发酵法发酵解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MT45和B.amyloliquefaciensX82生产surfactin，最终产量达到3.4 g/L。

值得关注的是，最近黄和教授课题组的Yi等[43]开发了半连续式发酵工艺，通过循环批次发酵BacillussubtilisBS-37生产surfactin，使固定化的细胞得以重复利用。他们将B.subtilisBS-37 固定在棉毛巾上，于5 L的搅拌槽反应器中发酵，结合泡沫分馏技术和半连续式操作达到循环批次发酵的目的。发酵过程中采用分阶段调控pH方式：菌株生长阶段(前6 h)pH稳定在5.0；产物积累阶段(7～24 h)pH稳定在7.5。经过7个批次的高效循环发酵，surfactin产量共计达7 887.3 mg/L，远高于其前期的流加发酵工艺。

图2 半连续切换培养工艺示意Fig.2 Sequential fed-batch fermentation with fill-and-draw operation

笔者所在课题组的He等[42]在前期研究生物表面活性剂鼠李糖脂(rhamnolipid)的发酵生产中，开发了高效的半连续切换培养工艺，如图2所示。经研究发现：培养5 d的发酵液，补加等体积的新鲜培养基，实现稀释产物和流加营养物质双重效果。此工艺可显著高效地提高鼠李糖脂的生产效率，并能显著缓解发酵过程中严重的泡沫问题，在生物表面活性剂发酵过程中具有良好的应用前景，但surfactin发酵过程中尚未见报道。

3 Surfactin在石油化工领域的应用研究现状

近年来，随着石油开采行业的快速发展和人们对环境要求的逐步提升，surfactin在石油化工领域的应用越来越受到关注，例如：surfactin可应用于三次采油，促进油水高效分离和原油污染土壤的修复等，这也是surfactin目前最具潜力的应用领域。

3.1 用于三次采油

微生物三次采油(microbial enhanced oil recovery，MEOR)是将微生物及其营养物质注入地下油层，使微生物在油层中生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物，或单纯注入微生物发酵代谢产物，以提高油田采收率的采油方法[44]。根据操作方式的不同，MEOR可分为两类：第一类是异位微生物采油(ex-situ MEOR)，是将在地表发酵装置制备的微生物代谢产物注入油层提高油田采收率；第二类是原位微生物采油(in-situ MEOR)，是注入微生物，让其在岩层中生长繁殖，所产生的代谢产物(表面活性物质)用于提高原油采收率。限于岩层的环境和条件不可控，直接加入微生物的方式适用性差。因此，直接往油井内注入生物表面活性剂或外源表面活性剂产生菌[45]更为可行和常见。

大庆油田开发研究院的王大威等[46]分离得到一株产脂肽类生物表面活性剂工程菌B.subtilisZW-3，研究表明：该菌株代谢产生的surfactin耐高温(50～100 ℃)且耐高盐(12% NaCl)，pH(4～10)适应性好，菌株发酵生产的脂肽表面活性剂乳化性能和发泡性能较强，可以提高原油采收率5.1%，且与1.8%NaOH溶液复配后，可提高原油采收率9.2%。

Amani等[47]从农田土壤中分离得到一株产surfactin的枯草芽孢杆菌，将发酵的surfactin用于三次采油，排油圈实验结果表明，surfactin的加入提高了残余油的回收率约25%。Hossein等[48]筛选得surfactin产生菌B.subtilisNLiM 0110，原油驱油实验表明surfactin的加入使残余油回收率提高了10.1%。Liu等[49]研究发现，surfactin在其质量浓度低至30 mg/L时即可实现88.5%的原油洗脱效率和13.48%的原油驱油效率，且发酵产物中surfactin C含量越高时，其洗油效率和驱油效率越高。Albahry等[19]研究表明，surfactin的加入可将残余油的回收率提高9.7%，且surfactin还表现出温度(40～100 ℃)适应性好，化学稳定性高(在pH 6～12条件下活性稳定)，和耐高盐(20%NaCl)等特性。Surfactin这种良好的化学稳定性及其高效的表/界面活性对其用于三次采油非常重要，为surfactin在三次采油中的应用奠定了良好的基础。

图3 pH调控surfactin乳化和破乳示意图Fig.3 Oil-water emulsification and oil separation controlled by pH

Surfactin在驱油实验中的优异乳化活性奠定了它在三次采油中应用的基础，也受到了广泛的关注。然而，原油回收的另一关键步骤(破乳)却未引起足够重视。依据相关的破乳机制：破乳剂需具有比乳化剂更优的表面活性，而surfactin具有比大多数表面活性剂都优越的表面活性，因此，破乳由surfactin稳定的乳液难以实现。本课题组前期的研究发现，surfactin易在酸性环境下沉淀析出，应该可以实现surfactin稳定乳液的快速破乳并实现油相分离。因此，我们探究了pH对surfactin乳化活性的影响[50]，为进一步推进surfactin在MEOR中的应用奠定了一定的基础。研究表明：surfactin具有优异的乳化性，能很好地乳化不溶的油相；但其乳化活性在酸性环境下会迅速丢失，从而导致油相快速高效地分离。在pH为11时，surfactin可以很好地稳定乳液(图3)，油的乳化率高达98%。但当pH降至3.0时，乳液中的油相可快速分离，油的回收率可达98%以上。上述surfactin的pH敏感性让它在稳定乳液(乳化)和油水分离(破乳)之间只需通过pH的调节实现高效快速地切换，且surfactin的这种特性在多次乳化和破乳反复循环使用中仍然保持稳定。上述特性为surfactin用于三次采油奠定了更多的可行性。

3.2 原油污染土壤的修复

原油污染土壤对人类健康和生态系统构成了严重威胁，需对其进行无害化处理并避免二次污染。由于自身的环境友好特性，利用surfactin进行的原油污染土壤生物修复越来越受到关注。原油污染土壤主要包含两类污染物：疏水性有机污染物和重金属离子，两类污染物进入土壤后都会造成严重污染。疏水性有机污染物(HOCs)具有稳定的物化性质和强烈的毒性，极易吸附和富集于土壤中，是污染土壤的最主要成分之一。利用表面活性剂洗涤污染土壤可有效去除土壤中的HOCs[51]，但残留于土壤中的化学表面活性剂大多系石油基聚合物，难以被生物降解，对土壤易造成二次污染[52]。生物表面活性剂环境相容性好、毒性低，被认为是前景良好的HOCs污染修复剂。Lai等[53]研究发现两种生物表面活性剂(表面活性素和鼠李糖脂)都可以去除土壤中的总石油烃(TPH)，且去除效率远优于化学表面活性剂。牛明芬等[54]从油泥中分离得3株surfactin产生菌株，利用surfactin洗涤油泥，处理72 h后，油泥中的有机烃去除率分别达62.31%、81.69%和71.38%，为原油污染土壤的治理提出了一种可行方法。Surfactin修复土壤的另一途径是促进降解土壤有害物质，吕应年等[55]在农药污染土壤中添加surfactin或surfactin产生菌，结果都能显著促进降解有害成分，其中对硫丹杀虫剂的降解率可提高30%～45%。

研究表明，surfactin还可以选择性去除原油污染土壤中的Pb、Zn、Cu和Cd等重金属离子[55]。一般认为，其作用机理包括两种方式：与重金属形成络合物；降低土壤溶液表面张力，直接吸附与其接触的重金属。此外，还有研究发现，surfactin对有机态和氧化态Cu和Zn也具有良好洗脱作用[56]。

4 总结与展望

生物表面活性剂surfactin卓越的表/界面活性、可生物降解性和低毒性让它在石油化工领域中三次采油和原油污染土壤修复上具有化学表面活性剂所不具备的优势，因此也愈来愈受到人们关注。但由于高产菌株的缺失，发酵过程中泡沫积累以及产物的产量低且提取难度大等问题致使surfactin发酵成本及应用成本过高，无法与已市场化的化学表面活性剂相竞争。尽管大量的研究工作已在一定程度上提高了surfactin的生产效率，但仍无法满足实际需要。因此，高产菌株的发现、高效的surfactin发酵生产工艺以及培养条件的优化对于进一步促进surfactin的工业化生产仍至关重要。通过探究发酵过程中菌体浓度和surfactin产量之间的相互关系和引入高效的半连续切换培养工艺或许可进一步提高surfactin的产量。虽然surfactin在众多领域具有良好的应用前景，但高昂的生产成本限制了其与化学表面活性剂的竞争。因此，在化学表面活性剂处理性能差或无法有效处理的领域开发surfactin的应用可增强其竞争性，污油破乳或许可成为surfactin较有潜力的应用之一。

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