超高效液相色谱法测定Menaquinone-7原料药主成分及有关物质

宋 怡，孔凡建，李银科，王 泉

维生素K是一类天然存在的脂溶性维生素，维生素K2（甲基萘醌类，Menaquinone，简称MK）是一组在2-甲基-1，4-萘醌母核上有不同长度的聚异戊二烯侧链的化合物。Menaquinone-7（MK-7）属于维生素K2中的一类，它的侧链含有7个异戊二烯基团，结构式见图1。

维生素 K2主要通过微生物发酵产生［1－2］，也可由人工合成得到［3］。研究发现，维生素K2具有治疗和预防骨质疏松［4－6］、促进凝血等功能［7］，同时在治疗肝癌［8－9］、乳腺癌［10］等方面表现出良好的疗效。MK-7作为维生素K2最重要的一类，还具有防止血管钙化，降低冠状动脉心脏病的风险［11］，以及治疗类风湿性关节炎的功能［12］。

图1 MK-7的结构式Fig．1 Structural f or mula of MK-7

目前，尚未见到用超高效液相色谱法测定MK-7原料药主成分及有关物质的报道。本工作参考了国外对母乳、血液、食品中维生素K2的测定方法［13－17］，应用超高相液相色谱分析技术对 MK-7原料药主成分及有关物质进行测定，拟为MK-7质量标准的制定提供参考。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱系统，配二极管阵列检测器（DAD）和Open LAB CDS工作站；TB-215D型十万分之一电子天平；Elga型超纯水机。

对照品溶液：避光操作，称取 MK-7对照品25．21 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备溶液。移取1．00 mL对照品储备溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

MK-7对照品纯度为99．1%，无水乙醇、异丙醇为分析纯，甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水。

1．2 仪器工作条件

Agilent Eclipse pl us C18色谱柱 （2．1 mm×50 mm，1．8μm）；流动相为甲醇-水（98＋2）混合液；流量0．3 mL·min－1；检测波长为246 n m（主成分测定），270 n m（有关物质测定）；柱温30℃；进样量2μL。

1．3 试验方法

避光条件下，称取MK-7原料药25．12 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇超声溶解并定容，摇匀，制成供试品储备溶液。移取供试品储备溶液1．00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，配制供试品溶液，在仪器工作条件下进行测定。

移取4．00 mL供试品储备溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为有关物质供试品溶液。移取上述溶液1．00 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为有关物质对照溶液，在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2．1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对供试品溶液在波长200～400 n m内进行扫描，发现在波长246，270 n m处有最大吸收，见图2。

图2 MK-7紫外吸收光谱Fig．2 UV adsorption spectru m of MK-7

由图2可知：在波长246 n m处，杂质较少，无干扰；在270 n m处，杂质有明显吸收，且基线噪声较小。试验选择270 n m为有关物质的检测波长，246 n m为MK-7的检测波长。

2．2 溶剂的选择

分别用异丙醇、甲醇、无水乙醇溶解并稀释供试品，制成3份质量浓度为0．1 g·L－1的溶液，按仪器工作条件进样分析。3份溶液的峰形及对称性均较好，而异丙醇和无水乙醇能较快溶解样品，甲醇溶解样品的时间较长。从经济性方面考虑，试验选择无水乙醇作为溶剂。

2．3 专属性考察

取0．2 g·L－1供试品溶液共5份，1份在70℃恒温水浴中加热1 h，作为高温破坏溶液；1份在4300lx的强光下照射1 h，作为光照破坏溶液；其余3份分别加入0．1 mol·L－1盐酸溶液、0．1 mol·L－1氢氧化钠溶液、30 g·L－1过氧化氢溶液各1 mL加热1 h，并调节p H至中性，分别作为酸破坏溶液、碱破坏溶液、氧化破坏溶液。将5份专属性溶液和1份0．2 g·L－1供试品溶液按仪器工作条件，在波长270 n m下进样分析，色谱图见图3。

图3 不同条件下MK-7专属性试验的色谱图Fig．3 Chro matograms of specificity test of MK-7 under different conditions

由图3可知：MK-7在酸、碱、光照、高温及氧化条件下均不稳定，不同程度分解而产生杂质；但在上述色谱条件下各杂质峰与主成分峰均能较好地分离，对MK-7及有关物质的测定无干扰，说明建立的方法具有良好的专属性。由图3还可知：MK-7在碱性条件下几乎完全分解，在光照下产生的杂质较多，说明该物质对光敏感，易被碱破坏，故在生产、运输和储存的过程中应采取避光措施，并避免与碱性物质的接触。

2．4 系统适用性试验

分别将对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按仪器工作条件在波长246 n m处进样分析，色谱图见图4。MK-7的保留时间为7．05 min，理论塔板数为10 889，拖尾因子为0．94。

2．5 方法学考察

2．5．1 线性范围与检出限

移取MK-7对照品储备溶液适量，配制成质量浓度分别为0．005，0．010，0．025，0．050，0．100，0．200，0．400 g·L－1的对照品溶液系列，按仪器工作条件在波长246 n m处进样分析，记录色谱图及峰面积。以峰面积为纵坐标（y）和MK-7质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，MK-7的线性范围为0．005～0．400 g·L－1，线性回归方程为y＝1．430×104x－3．620×101，相关系数为0．999 8。

按3倍信噪比时的质量浓度计算得检出限（3S／N）为0．1 mg·L－1。

图4 对照品溶液、供试品溶液、空白溶液的色谱图Fig．4 Chr o matograms of standard solution，sa mple solution and blank solution

2．5．2 精密度试验

平行配制6份供试品溶液，在波长246 n m处进样分析，测得MK-7质量分数的平均值为98．0%，相对标准偏差（RSD）为0．6%，说明方法的精密度较高。

2．5．3 稳定性试验

取供试品溶液，在10℃下避光保存12 h，每隔2 h进样一次，按仪器工作条件在波长246 n m处分析，测得MK-7峰面积的RSD为0．7%。说明供试品溶液在12 h内，10℃避光条件下稳定性良好。

2．5．4 回收试验

称取MK-7供试品适量，按试验方法进行加标回收试验，结果见表1。

表1 回收试验结果Tab．1 Results of test for recovery

2．6 样品分析

称取2批MK-7原料药，按试验方法配制供试品溶液，在波长246 n m处进样分析。按外标法以峰面积计算MK-7的质量分数，结果见表2。

表2 样品中MK-7的测定结果（n＝3）Tab．2 Deter mination results of MK-7 in sa mples（n＝3）

2．7 有关物质测定

称取2批MK-7原料药，按试验方法配制有关物质溶液，移取对照溶液2μL，在波长270 n m处进样分析，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，再移取有关物质供试品溶液和对照品溶液各2μL，按仪器工作条件进样分析，记录色谱图至主成分保留时间的3倍，以自身对照法计算杂质含量，结果见表3。

表3 样品有关物质测定结果Tab．3 Deter mination results of the related substances in samples

由表3可知：2批MK-7原料药中单个杂质质量分数未超过0．5%，杂质总质量分数未超过1．0%，故可将单个杂质限量定为0．5%，杂质总量限量定为1．0%。

本工作应用超高效液相色谱技术，建立了测定MK-7原料药主成分和有关物质的方法。本方法分析时间短，专属性强，检出限低，结果准确可靠，可作为MK-7原料药的分析方法，用于其主成分与有关物质的检测分析，可为MK-7原料药质量标准的建立提供参考。参考文献：

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