MicroRNA-144-3p在胰腺癌中的表达及其对胰腺癌侵袭转移的影响

罗和生， 陈小丽， 田 霞， 黄晓东

1.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060； 2.武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)消化内科

胰腺癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，在美国是排名第四的肿瘤相关致死性疾病，有超过一半的胰腺癌患者确诊时已属晚期，5年生存率低于5%[1]。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是最常见的胰腺癌类型，早期症状不明显，容易发生远处转移，因而预后差，死亡率高。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类进化上高度保守，长约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与靶mRNA的3′非编码区(3′-untranslated region, 3′UTR)不完全或完全互补结合，抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA，在转录后水平调节基因的表达。研究[2]表明,miRNA与肿瘤的形成密切相关，胰腺癌中异常表达的miRNA可能通过调节原癌基因或抑癌基因的表达参与胰腺癌的发生、发展。有研究[3-5]报道,miR-144-3p通过不同的调控机制，在多种肿瘤中扮演抑癌基因的角色，例如胃癌、肾细胞癌、脑胶质瘤等，其中包括miR-144-3p通过靶向作用于原癌基因c-Met抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭[5]。虽然miR-144-3p在肿瘤中的报道较多，但在胰腺癌中的研究甚少，因此，本研究通过检测胰腺癌组织和细胞系中miR-144-3p的表达，观察其对胰腺癌侵袭转移的影响。

1 材料与方法

1.1临床标本本研究收集13对胰腺癌组织和对应癌旁组织标本(距癌组织边界≤3 cm)，样本取自2015年12月至2017年3月武汉市中心医院肝胆胰外科行胰十二指肠切除术的患者，男7例，年龄(4±9)岁；女6例，年龄(5±10)岁。所有标本术后病理诊断均为PDAC。组织标本离体后迅速置于液氮速冻，后储存于-80 ℃备用。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2细胞系及细胞培养人胰腺癌细胞系PANC-1、MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、SW1990和胰腺导管正常细胞H6C7均购自美国典藏细胞库(ATCC)，其中，PANC-1和MIA PaCa-2生长于DMEM培养基，BxPC-3和AsPC-1生长于RPMI 1640培养基，所有培养基均加入质量浓度为100 g/L的胎牛血清和10 g/L的青-链霉素，置于37 ℃，体积分数为5%的CO2的培养箱中恒温培养。

1.3主要试剂和仪器DMEM培养基、RPMI-1640培养基、转染用OPTI-MEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；miR-144-3p mimic及mimic NC购自上海吉玛公司；miR-144-3p逆转录试剂盒购自广州锐博公司；荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪公司；TRIzol、Lipofectamine LTX购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司；BCA蛋白测定试剂盒购自美国Thermo公司，ECL化学发光试剂盒购自美国GE公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG购自美国Santacruz公司，兔抗人ETS1多克隆抗体购自美国Abcam公司。紫外分光光度计购自美国Beckman公司、实时荧光定量PCR仪(StepOne plus)购自美国Lifetechnologies公司。

1.4qRT-PCR检测miR-144-3p的表达组织及细胞总RNA的提取采用TRIzol试剂，操作步骤按照试剂盒说明书进行。本文通过microRNA数据库miRBase中的TargeScan和miRDBA数据库均可预测到miR-144-3p可能的靶基因ETS1。紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度，取1 μg总RNA与1 μl逆转录酶、3 μl逆转录引物混合，在15 μl反应体系中，16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录。然后取1.33 μl逆转录产物 cDNA 与1 μl引物混合，在20 μl 反应体系中，95 ℃变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。U6作内对照，miR-144-3p的相对表达量在组织中用2-ΔΔCt计算，细胞系中用2-ΔΔCt计算。

1.5划痕实验检测细胞迁移能力将对数生长期的PANC-1细胞铺板，待细胞密度达到60%融合后，按照Lipofectamine LTX试剂盒说明书将mimic NC和 mimic分别转染入细胞，48 h后用200 μl经高压灭菌的枪头进行划痕，PBS洗2次后换用无血清的培养基，拍照后放入培养箱，待24 h后再次拍照。

1.6Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力

1.6.1 细胞迁移实验：细胞转染2 d后，用无血清培养基配制成5×104ml-1的细胞悬液，在Transwell上室加入200 μl细胞悬液，即细胞数每孔约1×104个，下室加入500 μl 完全培养基，每组设置3个副孔。将24孔板放入细胞培养箱，24 h后取出小室，多聚甲醛固定，吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照，每孔随机取5个视野进行细胞计数，计算平均值。

1.6.2 细胞侵袭实验：细胞转染2 d后，用无血清培养基配制成5×104ml-1的细胞悬液，在提前用Matrigel基质胶包被的小室中加入200 μl细胞悬液，即细胞数每孔约1×104个，下室加入500 μl 完全培养基，每组设置3个副孔。将24孔板放入细胞培养箱，24 h后取出小室，多聚甲醛固定，吉姆萨染色，显微镜下观察并拍照，每孔随机取5个视野进行细胞计数，计算平均值。

1.7Westernblotting检测蛋白表达水平利用RIPA裂解液(质量浓度为10 g/L的PMSF)裂解转染后的细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，取40 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将其电转移至PVDF膜，质量浓度为50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后室温孵育二抗1 h，洗涤后经ECL底物显色，显影，成像仪扫描结果。

2 结果

2.1胰腺癌组织及细胞系中miR-144-3p的表达胰腺癌组织和癌旁组织中miR-144-3p的表达量分别为3.26±1.94、16.21±9.82 (t=5.25，P<0.05)，胰腺癌组织中miR-144-3p的表达量显著低于癌旁组织(见图1A)。胰腺癌细胞系PANC-1、MIA PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、SW1990中miR-144-3p的相对表达量依次为0.48±0.08、0.43±0.05、0.69±0.08、0.56±0.08、0.42±0.10，与正常胰腺细胞(H6C7)相比，所有胰腺癌细胞系中miR-144-3p的表达均降低(t值分别为10.82、15.20、15.07、11.74、7.01，P<0.001)(见图1B)。

图1 胰腺癌组织及细胞系中miR-144-3p的表达 A：胰腺组织；B：细胞系Fig 1 Expression of miR-144-3p in pancreatic cancer tissues and cell lines A： the pancreatic tissues； B： the cell lines

2.2过表达miR-144-3p抑制PANC-1细胞的迁移和侵袭能力划痕实验显示,24 h后转染miR-144-3p mimic的细胞划痕愈合速度明显慢于mimic NC组(见图2)。同时，利用Transwell小室检测过表达miR-144-3p后细胞迁移侵袭能力的影响，结果显示，mimic组迁移细胞数为(239±22)个，mimic NC组为(569±26)个；mimic组侵袭细胞数为(132±16)个，mimic NC组侵袭细胞数为(228±21)个，过表达miR-144-3p组PANC-1 细胞迁移和侵袭到小室底部的细胞数明显减少(P<0.05，见图3)。

图2 过表达miR-144-3p抑制胰腺癌细胞PANC-1的迁移Fig 2 Overexpression of miR-144-3p inhibited the migrationof PANC-1 in pancreatic cancer cells

2.3过表达miR-144-3p靶向抑制PANC-1细胞ETS1蛋白表达利用生物信息学分析，在数据库TargetScan和miRDB中预测ETS1是miR-144-3p潜在的靶基因。软件预测ETS1 3′UTR区与miR-144-3p的结合位点，Western blotting结果显示,mimic组ETS1蛋白的表达水平明显低于mimic NC组(见图4A、4B)。

图3 过表达miR-144-3p抑制胰腺癌细胞PANC-1的迁移和侵袭Fig 3 Overexpression of miR-144-3p inhibited the migration andinvasion of PANC-1 in pancreatic cancer cells

图4 过表达miR-144-3p靶向抑制PANC-1细胞ETS1蛋白表达 A：预测ETS1 3′UTR区与miR-144-3p的结合位点；B：过表达miR-144-3p抑制PANC-1细胞ETS1蛋白表达Fig 4 Overexpression of miR-144-3p target to inhibit the expressionof ETS1 protein in PANC-1 cells A： prediction of the binding sites of ETS1 3′UTR region and miR-144-3p； B： overexpression of miR-144-3p inhibited the expression of ETS1 protein in PANC-1 cells

3 讨论

胰腺癌发病隐匿，进展迅速，其发病率和死亡率在全球范围内仍在增长[6]。胰腺癌的高死亡率与其易发生侵袭转移密切相关，有研究[7]表明,约80%的胰腺癌患者确诊时已发生远处转移，失去了手术根治的机会。异常表达的miRNA对多种肿瘤的发生、发展至关重要，多种miRNA被证实扮演着癌基因或抑癌基因的双重角色。近期研究显示，miR-144-3p在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用。LAN等[8]发现，miR-144-3p在脑胶质瘤中低表达，并可通过靶向作用原癌基因MET抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。LI等[9]在胃癌研究时发现，miR-144-3p可靶向下调前B淋巴细胞白血病转录因子(pre-leukemia transcription factor 3，PBX3)抑制上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，从而阻遏癌症进展，且发现在晚期、瘤体大和有淋巴结转移的癌组织中miR-144-3p的表达更低，表明miR-144-3p的水平与转移程度、肿瘤的大小、淋巴结转移及TNM分期有密切的联系。本研究中miR-144-3p在胰腺癌组织的表达较癌旁组织明显降低，且与正常胰腺细胞相比，其在胰腺癌细胞系的表达也显著降低，提示miR-144-3p在胰腺癌的发生、发展中可能起着抑癌基因的作用，且在胰腺癌细胞PANC-1中过表达miR-144-3p后，发现其迁移和侵袭能力明显降低。

ETS转录因子家族是转录因子中最大的一个家族之一，通过识别并结合其靶基因的启动子或增强子的GGA核心序列调控着重要的生物进程，如细胞的增殖、分化和凋亡[10]。ETS1作为ETS家族中最具代表性的转录调控因子，在肿瘤的生长、浸润、转移[11]和血管生成[12]等方面均起着不可替代的作用。ZHANG等[13]证实，ETS1在侵袭性乳腺癌中高表达，并且上调的ETS1与其预后不良有关，而且发现miR-125b在侵袭性乳腺癌中低表达，miR-125b可靶向作用于ETS1抑制肿瘤的形成。有研究[14]表明，ETS1可通过调节EMT减弱喉鳞癌细胞的生长、侵袭和转移能力，而且指出ETS1诱导的EMT可能与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达有关。本研究通过靶基因预测数据库筛选出ETS1是miR-144-3p的靶基因，并且过表达miR-144-3p可抑制ETS1的蛋白水平，并减弱胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，本研究发现，miR-144-3p在胰腺癌组织和细胞系中均低表达，并且通过靶向作用于ETS1抑制胰腺癌细胞的侵袭转移，然而，miR-144-3p抑制胰腺癌进展的具体机制是什么，调节miR-144-3p的表达是否抑制胰腺癌的发展并改善预后等问题还需进一步研究。

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