高产红曲色素和Monacolin K红曲霉菌的诱变选育

常聪，张安，程述敏，张文学

(四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065)

红曲是以大米为发酵基质，接种红曲霉菌，经发酵而得的一种色泽为紫红色的产物[1]。我国对红曲霉的应用历史悠久。红曲霉代谢产物繁多[2]，而红曲色素和Monacolin K是2种重要的代谢产物[3]。红曲色素作为天然优质食用色素，具有抗突变、防腐等作用[4,5]，在食品、医药等行业应用较广；Monacolin K能抑制人体胆固醇合成[6]，被认为是最佳的血脂调节物。目前国内外以同时提高二者产量为目的的诱变育种研究较少，而我国工业化生产红曲色素和Monacolin K普遍存在成本高、产量低的问题，因此提高红曲霉菌株发酵产红曲色素和Monacolin K的能力具有重要的现实意义。诱变育种是利用合理有效的诱变剂及诱变剂量处理微生物的单细胞，提高突变频率，再通过适当的筛选方法获得优质菌株的育种方法[7]。因此，文章采用对红曲霉单孢子悬液进行紫外线-氯化锂的复合诱变方法，对平板菌落初筛，对红曲色素、Monacolin K含量检测进行复筛，并进行遗传稳定性实验，旨在筛选出同时高产红曲色素和Monacolin K及具备良好遗传稳定性的红曲霉突变菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌种

从本实验室、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)共购买收集5株红曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 种子液培养基

马铃薯20%，无水葡萄糖2%，自然pH，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2.2 大米培养基

大米经清洗，于水中浸泡1 h，沥干水分，进行蒸煮至大米颗粒分散、微粘状态。蒸煮后的大米分别取30 g分装于250 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

色谱纯：甲醇、磷酸；分析纯：甲醇、无水葡萄糖、无水乙醇、无水氯化锂。

1.1.4 主要仪器设备

单人双面净化工作台、立式压力蒸汽灭菌锅、台式高速冷冻离心机、高效液相色谱仪、电热恒温真空干燥箱、恒温振荡培养箱、酶标仪、电子天平、磁力搅拌器、超声清洗机、可调万用电炉、电磁炉、蒸锅、40目筛等。

1.2 实验方法

1.2.1 红曲米制作方法

1.2.1.1 种子液

将红曲霉斜面孢子刮下置于三角瓶中，振荡充分，无菌脱脂棉过滤孢子液，将孢子稀释至浓度约为 106～107个/mL，即为孢子悬液，2%接种量接种于种子液培养基中，120 r/min摇床28 ℃培养48 h。

1.2.1.2 固态发酵红曲米

将种子液按照10%(V/V)接种量接种于装有30 g大米培养基的250 mL三角瓶中，并用无菌玻璃棒打散，于28 ℃培养14天。

1.2.2 红曲中Monacolin K的检测方法[8，9]

将红曲发酵产物于40 ℃下烘干研磨至40目，称取0.5 g于50 mL容量瓶中，加入适量无水甲醇，室温下超声1 h，中间间歇振荡3～4次最终定容到50 mL。以4000 r/min的转速离心10 min。取上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液取20 μL经HPLC测定方法检测，并根据HPLC标准曲线计算内酯式及酸式Monacolin K含量，并计算Monacolin K总含量。HPLC检测方法参考QB/T 2847-2007。

1.2.3 红曲中红曲色素的检测方法[10]

红曲色素提取及检测方法参考GB 1886.19-2015。

称取0.2 g烘干研磨后的红曲发酵产物，用70%乙醇溶液溶解并将其转入100 mL容量瓶中，定容，置于(60±0.5) ℃水浴中，浸泡1 h，冷却至室温，补充70%乙醇溶液至刻度，混匀后过滤，吸取一定体积的滤液于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液稀释定容至50 mL，摇匀，在505 nm的波长下测定处理后样品的吸光度A，并计算样品的色价。

式中：A为样品吸光度；m1为样品质量(g)；V为吸取乙醇浸泡液的体积(mL)。

1.2.4 红曲霉菌株产红曲色素和Monacolin K能力的测定

对5株红曲霉(QH，JP2，5046，40225，40938)的固态发酵产物进行Monacolin K和红曲色素的提取及检测。比较5株红曲霉固态发酵产红曲色素和Monacolin K能力，选择最优红曲霉菌株作为后续实验菌株。

1.2.5 诱变方法

1.2.5.1 紫外诱变

在避光的无菌操作台中，将装有5 mL制备好的单孢子悬浮液的无菌培养皿放置于磁力搅拌器上，将灭过菌的搅拌转子放置于培养皿中，开启搅拌器，使单孢子悬浮液一直保持搅拌状态，在紫外灯(25 W)下，保持垂直照射距离20 cm，将培养皿分别照射1，2，3，4，5 min。避光下将不同紫外诱变剂量的单孢子菌悬液分别稀释至10-3，取各诱变后的单孢子菌悬液及其稀释液0.1 mL涂平板，每个样品做3个平行。未经诱变的原菌液稀释同等梯度涂平板作为空白对照。平板静置20 min后于28 ℃恒温培养室中倒置培养3天左右，避光培养，以免发生光复活作用。待菌落生长出来观察并记数，计算致死率。一般来说，为了提高诱变成功率，应采取较高致死率的平板菌落继续进行后续实验，但过高致死率平板上的突变菌株容易发生回复突变的情况，性状不稳定。因此，选取致死率在70%～80%的平板的诱变剂量作为最佳诱变剂量。

式中：A为对照组菌落数；B为诱变组菌落数。

1.2.5.2 紫外-氯化锂复合诱变

将上述紫外诱变后的孢子悬浮液分别吸取0.1 mL涂布于氯化锂浓度分别为0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰的PDA平板上，每个梯度3个平行，并以不含氯化锂的PDA平板作为对照组。将以上PDA平板于28 ℃恒温培养室倒置培养3天。观察并记录菌落数，计算不同诱变剂量的致死率。

1.2.5.3 突变菌株筛选方法

初筛方法：以原始菌株菌落形态作为对照，选取最佳诱变剂量下的诱变菌落中，菌落直径、菌落颜色、菌丝疏密程度等与原始菌落有区别者，进行平板划线分离，获得突变单菌落。

复筛方法：初筛得到的单菌落接种于斜面PDA培养基中，28 ℃培养7天后转入种子液培养基中培养2天后，进行固态发酵培养14天，检测发酵产物中红曲色素和Monacolin K的含量，筛选出高产红曲色素和Monacolin K的突变菌株。

1.2.5.4 诱变菌株的遗传稳定性实验

将紫外-氯化锂复合诱变处理后，筛选得到的高产Monacolin K红曲霉突变菌株转接至斜面PDA培养基中，28 ℃恒温培养7天后作为第1代，第1代斜面菌落转接至新的斜面PDA培养基中，28 ℃恒温培养7天后为第2代，以此类推到第5代。每一代的红曲菌株都需进行固态发酵，发酵14天后检测红曲色素和Monacolin K的含量，筛选出遗传稳定性最高的菌株。

2 结果与分析

2.1 红曲霉菌株产Monacolin K能力的测定

对5株初始红曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)红曲色素和Monacolin K产量进行测定，见表1。

表1 5株初始红曲霉红曲色素色价和Monacolin K含量Table 1 Levels of Monascus pigments and Monacolin K in 5 original Monascus strains

注：“—”为未检出。

其中红曲霉QH的红曲色素相对较高，色价达1330 U/g，Monacolin K产量最高，为0.36 mg/g。后续将选用该菌株作为原始菌株，进行复合诱变育种高产Monacolin K菌株。

2.2 最佳诱变条件的确定

通过平板菌落计数，计算不同诱变剂量下的红曲霉菌致死率，制作诱变剂量与致死率的相关曲线，从而确定紫外-氯化锂的最佳复合诱变条件。

2.2.1 紫外诱变剂量的选择

图1 紫外诱变时间对红曲霉菌QH致死率的影响Fig.1 Effect of ultraviolet mutation duration on the lethal rate of Monascus QH

由图1可知，紫外诱变剂量达到2 min时，红曲菌致死率达到75%，所以确定2 min为紫外诱变的最佳诱变剂量。

2.2.2 紫外-氯化锂复合诱变剂量的选择

图2 氯化锂浓度对红曲霉菌QH致死率的影响Fig.2 Effect of LiCl concentration on the lethal rate of Monascus QH

由图2可知，氯化锂浓度达到0.6‰时，红曲霉菌致死率达到78%，所以确定氯化锂浓度为0.6‰作为复合诱变处理剂量。

2.2.3 紫外-氯化锂复合诱变筛选结果

2.2.3.1 诱变菌株初筛

选取最佳诱变剂量——紫外诱变2 min、氯化锂浓度0.6‰的平板菌落作为诱变菌落，诱变前后的红曲霉菌菌落形态对比见图3。

图3 诱变前后红曲霉菌落形态对比Fig.3 Colonial morphology of Monascus before and after mutation

注：左表示未经诱变，右表示紫外-氯化锂复合诱变后。

由图3可知，紫外-氯化锂复合诱变后的菌落形态与原始菌落形态有一定差别：诱变后的菌落直径较大，且边缘白色菌丝所占面积较未经诱变的菌落小，而中心橙红色部分菌丝所占面积较未经诱变的菌落大。挑选与原始菌落差别较大的单菌落进行平板划线分离及PDA斜面保藏。

2.2.3.2 诱变菌株复筛

经菌落形态初筛，获得紫外-氯化锂复合诱变菌株50株，编号为QH1～QH50，分别对其进行固态发酵并测定发酵产物中红曲色素和Monacolin K的含量，检测其是否高于原始菌株QH的色素和Monacolin K产量，若高于原始菌株QH则为正突变。50株红曲霉诱变菌株的代谢能力不一，有的突变株产量提高，有的突变株产量降低。红曲色素和Monacolin K产量同时提高最多的突变菌株见表2。

表2 诱变菌株QH12，QH14，QH46 红曲色素和Monacolin K含量及提高值

由表2可知，突变株QH12，QH14，QH46的红曲色素及Monacolin K产量较原始菌株均有所提高，红曲色素色价分别达到2450，3190，1960 U/g，是原始菌株的1.84，2.40，1.47倍；Monacolin K分别达到1.68，1.28，1.99 mg/g，是原始菌株的4.67，3.56，5.53倍，可见紫外-氯化锂复合诱变红曲菌株的产红曲色素和Monacolin K能力好。

2.2.4 诱变菌株的遗传稳定性实验

诱变后的突变菌株性状不稳定，培养过程中会出现突变性状衰退甚至消失，从而不能应用于工业生产，故要对突变菌株进行传代稳定性试验。对3株红曲菌突变株QH12，QH14，QH46分别连续传代4次，进行固态发酵实验并检测其红曲色素和Monacolin K产量，每次3个平行，取平均值，结果见表3。

表3 红曲霉菌诱变菌株产红曲色素和Monacolin K的情况Table 3 Production of Monascus pigments and Monacolin K in mutant strains

由表3可知，突变株每次传代后的红曲色素和Monacolin K产量均低于第1代突变株，降低幅度不定。两种产物综合考虑，其中QH12突变株降幅均较小，遗传性能比较稳定，因此选择该菌株作为继续研究的菌株。

方春玉等[11]采用物理(紫外、超声波、微波)诱变和化学(氯化锂)诱变相结合的方式对红曲进行诱变，诱变菌株产红曲色素的能力提高了约3倍。孙嘉龙等[12]采用紫外线照射45 s、氯化锂1.0‰的诱变剂量对红曲菌株进行复合诱变，筛选出高产Monacolin K的红曲突变菌株，其Monacolin K产量是原始菌株Monacolin K含量的3.3倍，且连续传接4代Monacolin K产量稳定。罗定军等[13]将Monacolin K产生菌采用紫外线(UV)和氯化锂(LiCl)对其原生质体进行复合诱变，经原生质体再生，获得高产菌株BTL23，BTL56，Monacolin K的产量比原来提高23.3%，并将高产菌株BTL23成功用于红曲Monacolin K的实际生产。而本研究采用紫外诱变2 min、氯化锂浓度0.6‰对红曲霉菌株QH进行复合诱变，得到高产红曲色素和Monacolin K且遗传性能稳定的突变菌株QH14，与以上研究结论有异曲同工之处，故说明采用紫外-氯化锂对红曲霉菌株进行复合诱变是合理、有效、有依据的。

3 结论

本文对5株原始红曲霉菌产红曲色素和Monacolin K的能力进行测定，其中红曲霉QH的红曲色素较高，Monacolin K产量最高，对其进行紫外-氯化锂复合诱变筛选高产红曲色素和Monacolin K的突变菌株。得到最佳诱变条件：紫外诱变时长2 min，氯化锂浓度0.6‰。经过菌落形态初筛，红曲色素和Monacolin K含量检测复筛，以及遗传稳定性实验，得到了高产红曲色素和Monacolin K且遗传稳定性能好的突变菌株QH12，其红曲色素色价达到2450 U/g，是原始菌株的1.84倍；Monacolin K产量达到1.68 mg/g，是原始菌株QH的4.67倍，两种代谢产物较原始菌株均有所提高。本文为高产红曲色素和Monacolin K工程菌株提供了有效的菌种资源，对红曲中色素和Monacolin K的学术研究具有意义。

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