产氨基甲酸乙酯降解酶酵母菌的选育及产酶条件优化

姚晓瑞宁，高飞飞，王斌，肖婧，史学伟*

(1.石河子大学 食品学院， 新疆 石河子 832000；2.石河子大学 信息科学与技术学院，新疆 石河子 832000)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate)是一种普遍存在于发酵食品中的有毒有害物质[1，2]。从20世纪40年代开始，不断有科学家证实了EC的致癌性，许多国家也出台了酒精饮料中EC含量的限值。2007 年，IARC(the International Agency for Research on Cancer)经评估后提升了EC的危险等级，将其从2B类致癌物质提高为2A类致癌物质[3]。几年来用于降低食品中EC含量的方法主要集中在减少前体物质、生产工艺调节和添加EC降解酶这几个方面，而酶解法无疑是最有效、最直接的途径。而作为大多数食品中的主要发酵剂，酵母菌的发酵产酶性能一直是近年来大家关注的焦点，本实验通过大量筛选，发现了一株可以降解EC的酵母菌，并对其产酶条件进行了优化，明显提升了酶活，对EC的降解起到了良好的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

来自新疆石河子周边团场、新疆巴音郭楞蒙古自治州各大葡萄产区的酿酒葡萄。

1.1.2 培养基

YEPD培养基：蛋白胨2%、酵母浸粉1%、琼脂2%，均为美国Sigma公司生产；葡萄糖2%(天津致远化学试剂有限公司)，自然pH，115 ℃灭菌30 min。

筛选培养基[4-6]：氯化钠0.2%、磷酸二氢钾0.25%、硫酸铵0.4%、氯化锰0.01%、硫酸锌0.015%，以上试剂均购自天津致远化学试剂有限公司，氨基甲酸乙酯0.25%(美国Sigma公司)，pH 5，115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基：蛋白胨1%、酵母浸粉1%、葡萄糖2%、氨基甲酸乙酯0.2%，自然pH。

1.1.3 主要试剂

BioFlux DNA试剂盒；BIOWEST琼脂糖；Trans2K DNA Marker；2×Easy Taq PCR SuperMix；柠檬酸；柠檬酸钠；氯化铵；硫酸，均购自天津致远化学试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器设备

分光光度计、离心机、PCR仪、电泳仪、血球计数板。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离和纯化

用20 mL无菌水浸泡洗涤新疆酿酒葡萄，将表皮上的微生物洗入无菌水中，取1 mL洗涤液进行梯度稀释，每个稀释梯度涂布3个平板(YEPD培养基)，28 ℃培养24 h，将平板上不同形态的菌株单独划线培养，每株菌3个平行，通过显微镜观察，挑选出具有酵母菌形态的菌株。接入到筛选培养基中，在以EC为唯一碳源的培养基上能生长的菌株具有能降解EC的能力[7]。

1.2.2 菌株鉴定

吸取1 mL液体培养基转移入1.5 mL离心管中，14000 r/min离心3 min，弃上清液，沉淀为目的菌株。使用BioFlux DNA试剂盒提取DNA；PCR扩增条件为：50 μL反应体积，95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性1 min，52 ℃ 退火2 min，72 ℃ 延伸1 min，循环35次，72 ℃ 延伸10 min[8]。取3 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，条带清晰，送上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果经NCBI Blast比对。

1.2.3 EC酶活定义

常温常压、中性pH条件下，每1 min分解EC产生1 nmol氨或1 nmol乙醇的酶量为1个酶活单位(U)。

1.2.4 粗酶液的制备

将筛选出的菌株接入不加琼脂的液体筛选培养基中，培养48 h，离心将菌种分离，用柠檬酸缓冲液(pH 5)洗涤2次，离心沉淀。冰浴超声破碎，破碎液于4 ℃ 12000 r/min离心5 min，取上清液，即为粗酶液[9]。

1.2.5 酶活测定方法

取2支试管，分别加入200 μL EC溶液，25 ℃水浴加热40 min，向2支试管中分别加入100 μL粗酶液，向其中一支试管中加入50 μL 0.1 mol/L硫酸使酶失活，作为空白对照，另一支试管放入25 ℃，水浴1.5 h，后同样加入50 μL 0.1 mol/L硫酸终止反应，按照Berthelot 反应显色法，在波长625 nm下测定吸光值，计算酶活[10-12]。

1.2.6 标准曲线绘制

用氯化铵配制不同浓度的标准溶液，在波长625 nm下测定吸光值，绘制标准曲线。

1.2.7 菌株产酶优化

在实验前，先用血球计数板计算液体培养基中酵母菌的个数，在做每个因素的实验前，用无菌水将菌液稀释至相同的数量级，减少试验误差。本文统一为106数量级。

1.2.7.1 发酵温度对产酶的影响

将菌株按发酵培养基体积的2%添加，分别在24，26，28，30，32 ℃，培养7天，测定其产酶能力。

1.2.7.2 初始pH对产酶的影响

将菌株按发酵培养基体积的2%添加，初始pH调整为4，5，6，7，8，9，10，在28 ℃培养7天，测定其产酶能力。

1.2.7.3 接种量对产酶的影响

将菌株按发酵培养基的1%，2%，3%，4%，5%添加，pH 6，28 ℃培养7天，测定其产酶能力。

1.2.8 酶学性质分析

1.2.8.1 pH对酶活性的影响

分别配制pH为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的缓冲液，加入粗酶液，测定酶的最适反应pH。

1.2.8.2 温度对酶活的影响

将粗酶液置于25，30，35，40，45 ℃下，分别测定酶活。

1.2.8.3 热稳定性研究

将粗酶液置于30，40，50 ℃下保温100 min，间隔20 min测1次酶活。

1.2.8.4 金属离子对酶活性的影响

将粗酶液中加入1 mmol/L的不同种金属离子(Cu2+，Fe2+，Ca2+，Mn2+)，35 ℃放置12 h，测定酶活，去离子水做空白。

2 结果与分析

2.1 菌株分离

从葡萄表皮共分离出120株菌，其中按照形态学挑选出50株酵母菌[13]，经筛选培养基筛选出1株生长良好的菌株，见图1。

图1 酵母菌形态 Fig.1 Morphology of yeast

2.2 菌株鉴定

PCR扩增产物电泳条带大约在500 bp左右，ITS核酸序列测序结果为：GGGTTACTGCTGATTTATATCTTATACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATAATACCATGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGTTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACATTTAGCACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGAGGAA；经Blast同源性比对，结果显示为与PichiafermentansKY076614.1 的ITS核酸序列相似度为97%。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳见图2。菌株YX22 ITS 基因发育树见图3。

图2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Fig.2 PCR amplification product agarose gel electrophoresis

图3 菌株YX22 ITS 基因发育树Fig.3 The ITS genetic tree of strain YX22

2.3 标准曲线

NH4+测定标准曲线见图4。

图4 NH4+测定标准曲线Fig.4 The standard curve of NH4+

2.4 菌株产酶优化

2.4.1 温度对产酶的影响

图5 温度对产酶的影响Fig.5 Effect of temperature on enzyme production

由图5可知，酵母菌随着温度增加产酶能力逐渐增加，在28 ℃时产酶活力较高，之后随着温度增加产酶能力逐渐降低，但在26～30 ℃的范围内，产酶性能均良好。

2.4.2 初始pH对产酶的影响

图6 pH对产酶的影响Fig.6 Effect of pH on enzyme production

由图6可知，在pH 4～10的范围内，菌株产酶能力出现先增后降，在pH 4～7的范围内平稳增长，pH>7之后出现明显下降，证明菌株在pH中性偏酸性时有良好的产酶能力，优势明显。

2.4.3 接种量对产酶的影响

图7 接种量对酶活的影响Fig.7 Effect of inoculation amount on enzyme activity

一般来说，接种量越大，积累的酶越多，但是在实验室封闭培养的条件下，营养物质有限，如果接种量过多，会使得单个酵母菌细胞能利用的营养物质变少，从而减少产酶量，由图7可知，接种量在2.5%时产酶量明显增加。

2.5 酶学性质分析

2.5.1 最适pH

图8 pH对酶活的影响Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

由图8可知，当pH由4上升到7时，酶活力稳步增加，高于7时则大幅下降，说明此酶的耐酸性较好，而碱性环境会使其活力降低，原因可能是碱性环境破坏了酶的正常结构，从而影响了酶的活力；pH在6～7时，酶活力变化不大，故最适pH为6～7。

2.5.2 最适温度及热稳定性

图9 温度对酶活的影响Fig.9 Effect of temperature on enzyme activity

由图9可知，温度在低于30 ℃的范围内，随着温度的增加，酶活力增大；温度高于30 ℃时，酶活力逐渐降低，在30 ℃时，酶活力最高。

图10 热稳定性Fig.10 Thermal stability

由图10可知，在各个温度条件下，酶的活性都相对稳定，在30 ℃下保温100 min后，酶的活力仍保留74%，证明在此温度下酶的活性有良好的稳定性；在40 ℃和50 ℃的条件下，保温100 min后，酶活力分别剩余59%和44%，说明此酶在高温条件下不稳定，易失活。

2.5.3 金属离子对蛋白活性的影响

表1 金属离子对酶活力的影响Table 1 Effect of metal ions on enzyme activity

由表1可知，Cu2+和Fe2+对酶活力有激活作用，而Ca2+和Mn2+均有抑制酶活的作用，其中Fe2+的激活作用最明显，而Ca2+的抑制作用最明显。

3 结论

在葡萄酒酿造过程中，酿酒酵母和细菌的共同发酵作用产生了EC，从1971 年，Löfroth等[14，15]在葡萄酒、啤酒中发现了EC，到1976 年，Ough[16]证明了葡萄酒中含有EC，之后陆续的研究也证明了葡萄酒中EC的致癌性，而EC的前体物质众多，它本身又是一种化学性质稳定的物质，所以用生物产酶降解的方法是目前认为最可靠的方法；1990 年，Fujinawa S等[17]成功将酸性脲酶应用于葡萄酒中，使得酒液中的尿素减少，从而降低EC的含量。本实验从酿酒酵母表皮上成功分离纯化了一株酵母菌，通过ITS序列测定分析后确定为发酵型毕赤酵母(Pichiafermentans)；酶学性质研究表明：该酵母菌最适产酶温度为28 ℃，最适产酶初始pH为7，最适产酶接种量为2.5%；该酵母菌所产酶的最适pH为6～7，最适温度为30 ℃，并且在此温度下酶活稳定性较好，Fe2+对此酶有激活作用，说明金属离子可以提高该酶的活性。将可以产EC酶的酵母菌作为发酵剂直接或者混合加入，会更直接、更有效地降低酒精饮料中EC的含量。

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