葡萄酒中有机酸和甘油掺伪鉴别检测方法的研究

刘锐萍，赵广西，杨 帛，刘 浩，裴庆润，刘珊珊，张克义

(国家葡萄、葡萄酒质量监督检验中心（秦皇岛）/秦皇岛市食品药品检验中心，河北秦皇岛066000）

随着科技的发展和各种检测手段的出现，葡萄酒的掺假手段也有很大的变化。葡萄酒掺假已从简单的掺水稀释和添加廉价的替代物发展到根据各种葡萄酒的组成经过周密的工艺设计而进行非常精细的添加，使用甘油、有机酸、天然色素等物质造假勾兑等问题同时存在，使葡萄酒的鉴伪检测变得越来越困难。虽然国内外的研究机构在这方面也做了大量的研究工作，但由于检测方法、产地、品种、加工工艺等条件的限制，至今没有一套成型的评价方法。

丙三醇又名甘油，是酵母酒精发酵的副产物，具有甜味并产生圆润的口感，可增加挂壁效果。葡萄酒中的甘油含量一般为5～10 g/L。丙三醇具有几乎与葡萄糖相同的甜味强度，在口感上，丙三醇的甜味可以立即表现出来：它加强葡萄酒的厚实感，并赋予葡萄酒柔和、肥硕的感官特征，适量的丙三醇对提升葡萄酒的口感有益。我国GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]中规定不允许在葡萄酒中添加丙三醇，而我国葡萄酒产品标准未对葡萄酒中的丙三醇含量作相关规定。一些葡萄酒生产企业为了改善葡萄酒的口感、提高干浸出物含量、增强葡萄酒的挂壁效果，在葡萄酒中人为添加丙三醇（甘油），这不仅违反了葡萄酒原汁酿造的原则，也给葡萄酒的制假售假创造了机会。丙三醇的检测方法多种多样，常见的有高效液相色谱法[2-7]、分光光度法[8]、酶联免疫法[9-10]、气相色谱法[11-12]、高效毛细管电泳-安培检测法[13]、气质联用法[14]等，其中以高效液相色谱法应用最为广泛。

葡萄酒中存在的有机酸有多种，主要有酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸等，它们是葡萄酒的主要呈味物质之一，决定了葡萄酒的酸度，与葡萄酒品质的优劣有很大关系，调节着葡萄酒的酸碱平衡，影响葡萄酒的口感、色泽和生物稳定性。鉴于有机酸对葡萄酒品质的重要影响，关于其检测方法的研究很多，最成熟完善的是高效液相色谱法[15-25]，另外，近年来使用液质联用法检测有机酸的研究也逐渐兴起。葡萄酒中有机酸的含量及组成也是鉴别葡萄酒掺假与否的重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酒样：干白葡萄酒、干红葡萄酒，经确认未掺假，葡萄酒企业提供，各20个样品；经确认掺假葡萄酒，各2个样品。

试剂及耗材：酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸），色谱纯，Sigma-Aldrich公司生产；甘油，色谱纯，天津市化学试剂三厂。

仪器设备：有机酸检测设备：Agilent 1100高效液相色谱仪(配有紫外检测器)，美国安捷伦公司；HHS-21-8型智能数显电热恒温水浴锅，NOKi诺基仪器有限公司；甘油检测设备：Agilent 1100高效液相色谱仪(配有示差检测器)，美国安捷伦公司；HHS-21-8型智能数显电热恒温水浴锅，NOKi诺基仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 有机酸检测色谱条件

色谱柱：phenomenex C18synergi 4µHydro-RP 80A C182.1×250 mm，5 μm。

柱温箱温度：30℃。

流动相：A：乙腈、B：1 g/L磷酸；经0.22µm微孔滤膜过滤。

梯度洗脱，见表1；流速：1mL/min；进样量：10μL。

Transwell结果显示，与control组与空白组比较，下调EZH2表达时穿过基膜的MDA-MB-468细胞数目明显增加(P＜0.05)，control组与空白组细胞侵袭能力比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4

表1 流动相梯度洗脱

检测器：紫外检测器；检测波长：214 nm。

1.2.2 甘油检测色谱条件

色谱柱：COSMOSILSugar-D4.6×250mm，5μm。

柱温箱温度：40℃；流动相：水+乙腈(25+75)流动相：等度。

流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

检测器：示差检测器。

1.2.3 样品处理

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中附录D规定的样品前处理方法进行样品的前处理。

2 结果与分析

2.1 干白葡萄酒有机酸和丙三醇（甘油）含量分析

表2 干白葡萄酒中有机酸和甘油检测结果统计表 (g/L)

对20个不同厂家的干白葡萄酒，分别检测酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）6种有机酸和甘油，计算有机酸总量，并计算苹果酸、乳酸之和占有机酸总量的百分比，详细结果见表2。

由表2可以看出，20个干白葡萄酒中这6种有机酸均有检出，6种有机酸含量比例无规律性关系，含量比较高的是酒石酸、苹果酸和乳酸，由于干白葡萄酒的酿造工艺中多数不进行苹果酸-乳酸发酵，因此多数干白葡萄酒中苹果酸的含量较高，其中苹果酸和乳酸的含量占总有机酸量的48%以上。由图1可以看出，未掺假干白葡萄酒中有机酸总量均在5.0～7.2 g/L之间，而2个掺假的干白葡萄酒中的有机酸总量低于5.0 g/L。未掺假干白葡萄酒中甘油均有检出，含量均在4.0～11.0 g/L之间，而2个掺假的干白葡萄酒中丙三醇含量均在14.0 g/L以上。

2.2 干红葡萄酒有机酸和丙三醇（甘油）含量分析

对20个不同厂家的干红葡萄酒，分别检测酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）6种有机酸和甘油，结果见表3。

由表3可以看出，干红葡萄酒中这6种有机酸均有检出，6种有机酸含量比例无规律性关系，含量比较高的是酒石酸和乳酸，由于干红葡萄酒的酿造工艺中多数进行苹果酸-乳酸发酵，因此多数干红葡萄酒中苹果酸的含量较低，苹果酸和乳酸含量占有机酸总量的50%以上。由图1可以看出，未掺假干红葡萄酒中有机酸总量均在5.5～9.8 g/L，而2个掺假的干红葡萄酒中有机酸总量低于5.0 g/L。未掺假干红葡萄酒中甘油均有检出，含量均在4.0～13.0 g/L之间,而2个掺假的干红葡萄酒中丙三醇含量均在15.0 g/L以上。

丙三醇是酒精发酵过程中形成的副产物，其形成与原料、酵母菌种和发酵条件有关，葡萄酒中的甘油含量一般为5～10 g/L，通过我们的实验研究基本上证明了这一点。丙三醇具有几乎与葡萄糖相同的甜味强度，在口感上，丙三醇的甜味可以立即表现出来；它加强葡萄酒的厚实感，并赋予葡萄酒柔和、肥硕的口感特征，适量的丙三醇含量对提升葡萄酒的口感有益。我国GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定不允许在葡萄酒中添加丙三醇，而我国葡萄酒产品标准未对葡萄酒中的丙三醇含量作相关规定。一些葡萄酒生产企业为了改善葡萄酒的口感、提高干浸出物含量、增强葡萄酒的挂壁效果，在葡萄酒中人为添加丙三醇（甘油），这不仅违反了葡萄酒原汁酿造的原则，也给葡萄酒的制假售假创造了机会。综合分析认为，葡萄酒中有机酸总量低，但是甘油含量过高，可推断该款葡萄酒为劣质葡萄酒，并且有造假的嫌疑。但是仅凭有机酸含量的高低并不能直接判定葡萄酒的真伪，只能推测该款葡萄酒质量不高，有些掺假葡萄酒中会人为添加柠檬酸或其他酸以弥补葡萄汁中酸度的不足，最终导致柠檬酸超过国家标准的要求。

表3 干红葡萄酒中有机酸和甘油检测结果统计表 (g/L)

为此，我们进一步采用特征图谱分析葡萄酒中的有机酸组成。

2.3 葡萄酒中的有机酸组成特征图谱分析

选取未掺假的干白、干红葡萄酒各9个样品，掺假的干白、干红葡萄酒各1个样品，分别按照前述的色谱条件进行图谱扫描，分别见图1和图2。图1为干白葡萄酒，图2为干红葡萄酒。每个图最上面一款分别为掺假葡萄酒的有机酸组成图谱，下面9个为真葡萄酒的有机酸组成图谱。

未掺假干白葡萄酒共检测到13个特征峰，9个样品重叠性比较好，出峰时间见图1。共有6个已知峰，分别为酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸，其余7个未知峰。据此推断未掺假的干白葡萄酒中均应该有这13个特征峰，如果缺少部分峰，则认为该葡萄酒为掺假葡萄酒，但是如果某白葡萄酒特征峰全部存在则不能直接判定该酒为真葡萄酒，可能是半汁葡萄酒，需要结合甘油含量、有机酸总量、色素含量等进行综合判定。如掺假干白葡萄酒的图谱中缺少峰9、峰10和峰11，与真葡萄酒图谱明显不同，进一步印证了我们的检测结论。

未掺假干红葡萄酒共检测到14个特征峰，9个样品重叠性比较好，出峰时间见图2。共有6个已知峰，分别为酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸，其余8个未知峰。据此推断未掺假的干红葡萄酒中均应该有这14个特征峰，如果缺少部分峰，则认为该葡萄酒为假葡萄酒，但是如果某红葡萄酒特征峰全部存在则不能直接判定该酒为真葡萄酒，可能是半汁葡萄酒，需要结合甘油含量、有机酸总量、色素含量等进行综合判定。如掺假干红葡萄酒的图谱中缺少峰5、峰10和峰11，与真葡萄酒图谱明显不同，进一步印证了我们的检测结论。

图1 10个干白葡萄酒有机酸组成特征峰构成图

图2 10个干红葡萄酒有机酸组成特征峰构成图

3 结论

通过有机酸及丙三醇含量分析，可以得出以下3点结论：

（1）未掺假葡萄酒中的丙三醇含量在4.0～13.0 g/L之间，含量超过15.0 g/L则可推测葡萄酒中人为添加了外源性甘油。

（2）未掺假干白葡萄酒中有机酸总含量在5.0～7.5 g/L之间，未掺假干红葡萄酒中有机酸总含量在5.5～10.0 g/L之间，而4款掺假的干白、干红葡萄酒有机酸总量均低于5.0 g/L。

综合分析认为，葡萄酒中有机酸含量低，但是甘油含量过高，可推断该款葡萄酒为劣质葡萄酒，并且有造假的嫌疑。但是仅凭有机酸含量的高低并不能直接判定葡萄酒的真伪，只能推测该款酒有质量问题，有些掺假葡萄酒中会人为添加柠檬酸或其他酸以弥补葡萄汁中酸度的不足，最终导致柠檬酸超过国家标准要求。

（3）未掺假的干白葡萄酒中均有13个特征峰，未掺假的干红葡萄酒中均有14个特征峰，如果缺少部分峰，则可鉴别该葡萄酒为掺假葡萄酒。

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