响应面法优化鸡蛋清中蛋白质的超声-微波协同提取工艺

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(陕西工业职业技术学院化工与纺织服装学院,陕西咸阳 712000)

鸡蛋作为人们膳食中获取蛋白质的主要食品,深受人们的青睐。鸡蛋清主要由蛋白质和水组成,占整个蛋重的60%以上,富含多种生物活性蛋白,主要有54%卵白蛋白(ovalbumin)、13%卵转铁蛋白(ovotransferrin)以及11%卵类黏蛋白(ovomucoid)等[1-3]构成,这些蛋白的生物活性功能已经得到人们越来越广泛的认可[4-7]。我国虽然是鸡蛋产量大国,连续数年鸡蛋总产量位居世界第一,然而,蛋品加工业发展缓慢,产品附加值较低[8-9]。

在蛋产品生产过程中,由于饮食习惯和食品行业的特殊需求,以蛋黄为原料生产卵磷脂、胆碱等已实现工业化,蛋黄需求量较大[10],而蛋清在生产过程中却被大量丢弃,造成资源浪费和环境污染[11]。有医学研究者认为鸡蛋是不健康的食品,主要原因是鸡蛋中胆固醇和脂肪含量较高,尤其不适合老年人食用[12]。因此,采用简单、快速的方法有效提取鸡蛋清中的活性蛋白,对充分利用我国丰富的禽蛋资源,提高蛋产品附加值,推动鸡蛋清中的蛋白质在食品、医药及保健品当中的应用具有非常重要的意义[13]。

本研究以鸡蛋清为原料,以蛋白质为分离提取对象,以水为提取剂,采用超声-微波协同提取法提取鸡蛋清中的蛋白质,利用响应曲面法(Response surface methodology,RSM)优化提取条件,建立超声-微波协同提取、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法,旨在为鸡蛋的综合开发利用提供参考依据[14-15]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 陕西省咸阳市购物超市;无水乙醇 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白标准品(BSA) 中国药品生物制品检定所;考马斯亮蓝G-250 德国达姆施塔特市默克公司。

XO-SM200微波超声波组合反应系统 南京先欧仪器制造有限公司;S-Star蛋清分离器 顺财不锈钢厨具厂;HR120精密电子天平 日本AND公司;FD-1A冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 将新鲜鸡蛋打碎在干净的烧杯里,采用蛋清分离器分离出蛋清,打发30 min致硬性发泡,将蛋清均匀涂层于载玻片表面,-40 ℃冷冻干燥12 h,最后碾磨呈粉末状,过40目筛储存备用[16]。

1.2.2 超声-微波协同提取方法 取1.2.1所述蛋清样品粉末4.0 g,置于微波超声波组合反应系统专用玻璃反应瓶中,加入一定体积二次去离子水,密封,连接回流装置,按所设定的超声和微波条件进行提取,提取结束后,过滤,采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量,计算得率[17]。

蛋白质得率(%)=(蛋白质质量/样品粉末质量)×100。

1.2.3 单因素实验设计 根据1.2.2中蛋白的提取方法,分别考察不同微波功率、液料比、超声功率和提取时间对蛋白质得率的影响。

1.2.3.1 微波功率 选择液料比为12∶1 (mL/g),超声功率为340 W,提取时间为9 min,微波功率设置水平分别为300、400、500、600、700 W,在此条件下,考察不同微波功率对蛋白质得率的影响。

1.2.3.2 液料比 选择微波功率为500 W,超声功率为340 W,提取时间为9 min,液料比水平分别为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1 (mL/g),在此条件下,考察不同液料比对蛋白质得率的影响。

1.2.3.3 超声功率 选择微波功率为500 W,液料比为12∶1 (mL/g),提取时间为9 min,超声功率设置水平分别为220、280、340、400、460 W,在此条件下,考察不同超声功率对蛋白质得率的影响。

1.2.3.4 提取时间 选择微波功率为500 W,超声功率为340 W,液料比为12∶1 (mL/g),提取时间分别为3、6、9、12、15 min,在此条件下,考察不同提取时间对蛋白质得率的影响。

1.2.4 响应曲面法实验设计 在单因素实验结果的基础上,根据Box-Behnken中心组合设计(BBD)实验原理,选择微波功率(A)、液料比(B)、超声功率(C)、提取时间(D)四个因素,每个因素选取高、中、低三个水平,采用四因素三水平的响应曲面方法设计实验,实验因素与水平设计见表1。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次，采用Design-expert 7.0.0统计软件对试验数据进行响应面分析。

表1 响应曲面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 微波功率对蛋白质得率的影响 微波功率对蛋白质得率的影响如图1所示,从图1中可知,开始时,随着微波功率的增大,蛋白质得率呈现增大的趋势,当微波功率增大到500 W时,蛋白质得率达到最大,之后,随着微波功率的继续增大,蛋白质得率开始下降,这可能是由于微波功率过大引起蛋白质变性[18-19],最终导致蛋白质得率下降,所以选择微波功率为500 W。

图1 微波功率对蛋白质得率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the yield of proteins in egg white

图2 液料比对蛋白质得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of proteins in egg white

2.1.2 液料比对蛋白质得率的影响 不同液料比对蛋白质得率的影响如图2所示,随着液料比的增大,蛋白质的得率逐渐增大,当液料比增大为12∶1 mL/g时,蛋白质得率最大,之后,随着液料比持续增大,蛋白质得率不再增大,呈现略微下降趋势。卵白蛋白含有大量的极性、亲水性氨基酸,比如谷氨酸、赖氨酸、精氨酸等,这些氨基酸非常有利于蛋白质和水分子之间形成氢键或者产生静电相互作用[20-21],适当增大液料比,有利于蛋白质的提取,但是液料比过大可能会引起部分蛋白质水解,导致蛋白质得率略微下降。实验结果表明适宜的液料比为12∶1 (mL/g)。

2.1.3 超声功率对蛋白质得率的影响 超声功率对蛋白质得率的影响如图3所示,开始时,随着超声功率的增大,蛋白质得率呈现增大的趋势,当超声功率增大到340 W时,蛋白质得率达到最大,之后,随着超声功率的继续增大,蛋白质得率开始下降,这可能是由于超声功率过大引起蛋白质变性,最终导致蛋白质得率下降。实验结果表明,适宜的超声功率为340 W。

图3 超声功率对蛋白质得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proteins in egg white

2.1.4 提取时间对蛋白质得率的影响 提取时间对蛋白质得率的影响如图4所示,提取时间为3 min时,提取不完全,得率较低,随着提取时间的延长,蛋白质得率逐渐增大,当提取时间延长至9 min时,蛋白质得率达到最大,9 min以后蛋白质得率无明显提升,因此选择提取时间为9 min。

图4 提取时间对蛋白质得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of proteins in egg white

2.2 响应曲面优化实验

2.2.1 BBD实验结果 在单因素实验的基础上,采用响应曲面法(Box-Behnken,BBD)对共计27个实验点进行实验,蛋白质得率如表2所示。

表2 BBD实验设计和实验结果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

2.2.2 回归模型方程的建立及显著性检验 利用Design-expert 7.0.0统计软件对表2的实验数据进行回归拟合,得到多元二次回归方程模型:

Y1=-360.411+0.297A+11.718B+1.231C+12.264D+7.000E-004AB+4.095E-004AC-8.333E-006AD+5.433E-006BC - 0.128BD - 7.433E-003CD-4.485E-004A2- 0.526B2- 2.053E-003C2-0.452D2,R2=0.9067。

表3 二次回归模型的方差分析结果Table 3 ANOVA for quadratic regression modle

图5 提取条件对蛋白质得率影响的响应曲面图Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of proteins

注：p值小于0.05,对应因素对响应值的影响显著。

对模型进行显著性检验分析,结果见表3。由表3可以看出,模型的p值为0.0004,小于0.05,表明实验所选用的二次多项模型方程具有显著性;失拟项F值为0.61(p=0.7564>0.05),表明失拟项相对于绝对误差不显著;回归方程显著,相关系数R2值为0.9067。因此,该模型对实验的拟合程度良好,能较好的反映各因素与响应值之间的真实关系,可以利用该模型分析和预测不同提取条件下蛋白的得率变化。模型的一次项对蛋白的得率影响均不显著(p>0.05);微波功率和超声功率交互项显著(p<0.05),其他交互相均不显著(p>0.05);二次项均显著(p<0.05),表明各因素对蛋白质得率的影响都不是简单的线性关系。

2.2.3 响应曲面分析与优化 根据回归方程模型可以绘制响应曲面图,考察拟合响应曲面的形状,分析微波功率、液料比、超声功率和提取时间各因素对蛋白质得率的影响。响应曲面图直观地反映了各因素及交互作用对各响应值的影响[22-25]。

图5(a)为微波功率和液料比对蛋白质得率影响的响应曲面图,可以看出,随着微波功率和液料比逐渐增大,曲面呈上升趋势,当微波功率为500 W,液料比为12∶1 (mL/g)时,得率开始趋于下降。可以确定最佳水平范围:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g)。

图5(b)～5(f)分别为微波功率和超声功率、微波功率和提取时间、超声功率和液料比、提取时间和液料比、超声功率和提取时间对蛋白质得率影响的响应曲面图,随着相应两个因素的增大,蛋白质得率均呈现先增大后减小的趋势,响应曲面开口向下,在所选范围内存在极值,即响应曲面最高点,同时也是等高线最小椭圆的中心点。可以确定最佳水平范围:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g),超声功率325～375 W,提取时间7.5～10.5 min。

通过软件分析,超声-微波协同提取鸡蛋清中蛋白质的最佳工艺条件为:微波功率499.66 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超声功率349.50 W,提取时间8.96 min,该最佳工艺条件下,蛋白质得率的预测值为55.20%。考虑到实际操作情况,将提取工艺参数修正为微波功率500 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超声功率350 W,提取时间9.0 min,三次平行实验得到蛋白质得率为56.21%±0.92%。

3 结论

本文在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken响应曲面优化法对超声-微波协同提取鸡蛋清中蛋白质的工艺进行了优化,主要探讨了微波功率、液料比、超声功率及提取时间等因素对蛋白质得率的影响。在所确定的工艺条件下,蛋白质的得率为56.21%±0.92%,表明此方法对鸡蛋清中蛋白质的提取比较彻底、得率高、用时短,而且操作简单,环保,对提升蛋产品附加值具有一定的参考价值。

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