小红豆抗菌蛋白的分离纯化及其功能活性

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(1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建福州 350002; 2.福州大学生物科学与工程学院,福建福州 350108)

植物抗菌活性蛋白,是植物抵御外界病原菌的一种物质,可抑制真菌的生长甚至杀死真菌[1]。植物在自然环境下生长发育的过程中,随时会遭受各种病原菌的侵染,随着植物体的进化发展,植物体本身逐渐形成了一套天然的防御系统,能够在植物体内合成一些物质来抵抗外源病菌,抗真菌活性蛋白就是植物抵御外界病原菌的一种物质[2-3]。抗菌蛋白通过抑制真菌生理代谢活动、降解真菌细胞壁、破坏真菌细胞膜、破坏细胞的核糖体及降解细胞中的核酸来保护植物体免受病原菌的浸染[4-5]。目前,对于抗菌生物活性蛋白的分离、活性表征、作用机理都有一定程度的探究[6-7],但相关理论及产业化生产的研究还有待进一步深入,随着植物生物活性蛋白研究的深入,其应用范围将会更广泛。

小红豆,是豆科类的一年生直立草本植物,种皮呈深红色,故又被称为红小豆、赤豆、红赤豆等。我国是小红豆的原产地和出口大国,而且小红豆营养丰富,口感细腻,广受人们的喜爱,被誉为粮食中的“红珍珠”[8]。据报道,每100 g小红豆中约含蛋白质21.7 g,蛋白质含量达22.65%,比大米的蛋白质含量高2～3倍[9-10]。此外,小红豆还具有较高的药用价值,对糖尿病、高血压、肝硬化、冠心病等现代高频性疾病具有较好的辅助疗效[11-12]。已有相关报道从红豆中分离纯化出具有抗恶性细胞增殖活性的多肽及HIV-1反转录酶抑制剂[15]。而从豆科植物中开发新的抗真菌活性蛋白应用于医学、食品、农业以及基因工程等方面具有重大意义。目前,已有从黑豆[13]、花生[14]中分离得到植物抗真菌蛋白的报道,而小红豆中的抗真菌蛋白未见报道。本文旨在从小红豆中分离纯化一种抗真菌蛋白,并对其生物活性进行表征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小红豆 福州永辉超市;尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum) 福建省农科院;Affi-gel Blue gel亲和色谱填料 日本TOSOH公司;Sephadex SP C-25阳离子交换色谱填料 英国Amersham Biosciences公司;Sephadex G-50凝胶过滤色谱填料 美国GE Healthcare;其余化学试剂均为分析纯。

XZ-21K型高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;FD-1C-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;UV/V-16/18型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;MINI PROTEIN Ⅱ电泳仪 美国BIO RAD公司;超净工作台 美国Thermo Forma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗真菌蛋白的分离与纯化

1.2.1.1 粗提液的制备 取25 g小红豆种子,加入适量的蒸馏水浸泡24 h,使豆子吸水完全膨胀后取出去皮,加入250 mL NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)缓冲液进行匀浆,经纱布过滤,除去残渣,收集滤液。滤液在4 ℃、10000 r/min下离心20 min,收集上清液即为小红豆蛋白的粗提液。

1.2.1.2 硫酸铵分级沉降 向蛋白质粗提液中加入固体硫酸铵,按标准的硫酸铵饱和度配制表计算添加至其饱和度达到20%,磁力搅拌充分溶解后,于4 ℃静置4 h,然后在4 ℃、10000 r/min下离心20 min,收集上清液。继续向上清液中加入硫酸铵至其饱和度达80%,溶解后于4 ℃静置4 h,在4 ℃、10000 r/min下离心20 min,取沉淀物,用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)缓冲液溶解沉淀,并用同样的缓冲液充分透析,截留规格3500 Da,在4 ℃温度下透析48 h,其间每8 h换一次透析液,即得到初分离样品。

1.2.1.3 亲和色谱纯化 将透析后的样品在4 ℃温度下12000 r/min转速离心10 min,去除沉淀,获得的上清液上样到已用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)缓冲液平衡的Affi-gel Blue gel亲和色谱柱中,并用同样的缓冲液洗去未吸附的蛋白(在280 nm下测定洗出液吸光值,小于0.05为洗涤终点),再用含0～1 mol/L NaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱,流速为0.5 mL/min,10 min/管,检测280 nm下的吸光值。

1.2.1.4 离子交换色谱纯化 将洗脱峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)缓冲液进行透析,截留规格3500 Da,在4 ℃温度下透析48 h,其间每8 h换一次透析液,离心后取上清液上样到已用同样缓冲液平衡好的Sephadex SP C-25阳离子交换色谱柱,洗去未吸附蛋白后(在280 nm下测定洗出液吸光值,小于0.05为洗涤终点),用含0～1 mol/L NaCl的缓冲液进行线性梯度洗脱,流速为0.5 mL/min,10 min/管,检测280 nm下的吸光值。

1.2.1.5 凝胶过滤色谱纯化 将洗脱峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)缓冲液进行透析,浓缩后在-50 ℃下冻干成粉末,用去离子水进行溶解,过0.22 μm的膜后用于凝胶过滤色谱。Sephadex G-50凝胶过滤色谱用去离子水平衡,上样结束后去离子水进行洗脱,直至洗出液在280 nm的吸光值小于0.05即认定所有蛋白都被洗出。

1.2.2 SDS-PAGE 采用Laemmli方法[15],不连续电泳体系(12.5%分离胶,4%浓缩胶),起始电压100 V,到达分离胶后电压升至120 V,考马斯亮蓝染色。由相对迁移率计算目标蛋白的相对分子质量。

1.2.3 蛋白含量的测定 以牛血清白蛋白为标准,采用Lowry方法测定样品蛋白含量[16]。蛋白标准曲线方程为:Y=0.0065X+0.0143,R2=0.9972。

1.2.4 抗菌蛋白抑菌活性的测定 采用琼脂片扩散法[17],真菌培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基,菌种采用来自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢镰刀菌。将受试菌分别接种于培养基平板中央,放置于30 ℃恒温培养箱中培养,待菌落直径长至4 cm左右时,在距菌落边缘0.5 cm处贴上无菌滤纸片(直径6.25 mm),并分别滴加8 μL浓度为40、20 μg/μL的抗菌蛋白溶液,将平板置于30 ℃中恒温培养,观察其抑菌活性。

1.3 数据处理

文中所有数据均取三次重复实验的平均值,采用Excel软件对数据进行分析,Origin 7.5软件作图。

2 结果与讨论

2.1 小红豆抗真菌蛋白的分离纯化

经过缓冲液抽提、硫酸铵沉降后获得的粗体液经Affi-gel Blue gel亲和色谱进行纯化,在280 nm下测量洗出液的吸光值,所得到的色谱图如图1所示。通过抑菌实验,测得洗脱峰A2具有抗真菌活性,收集并合并A2峰组分。

图1 小红豆抗真菌蛋白的Affi-gel Blue gel亲和色谱图Fig.1 Affinity chromatography of the antifungal protein from small red beans on Affi-gel Blue gel

图2 小红豆抗真菌蛋白的Sephadex SP C-25离子交换色谱图Fig.2 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex SP C-25

亲和色谱洗脱峰A2组分的成分经SDS-PAGE电泳鉴定后仍比较复杂,经透析后上样到离子交换色谱Sephadex SP C-25柱中。在280 nm下测量洗出液的吸光值,所得到的色谱图如图2所示。在平衡液条件下没有挂柱,直接被冲洗下来的峰称为穿透峰,被洗脱液洗脱下来的峰称为洗脱峰。由图2可知,亲和色谱洗脱峰A2经阳离子交换色谱后,得到一个穿透峰S1和两个洗脱峰S2、S3,通过抑菌实验,测得洗脱峰S3具有抗真菌活性,收集并合并S3峰组分。

离子交换色谱洗脱峰S3组分经SDS-PAGE电泳鉴定后,出现两条分子量相差较大的电泳条带,S3组分经透析、冻干浓缩后,用去离子水溶解,并上样到凝胶过滤色谱Sephadex G-50柱中。在280 nm下测量洗出液的吸光值,所得到的色谱图如图3所示。

图3 小红豆抗菌蛋白的Sephadex G-50凝胶过滤色谱图Fig.3 Gel filtration chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex G-50

由图3可知,S3组分经凝胶过滤色谱后只得到1个主要的色谱峰G1,显然经过层层分离纯化后,样液中含有的蛋白种类越来越少,更趋向于目标蛋白。G1组分经活性检测被证明具有抑制真菌生长的生物活性,收集目标组分并重复制备,以备后续研究。

2.2 SDS-PAGE

将分离纯化各个步骤得到的组分进行SDS-PAGE电泳鉴定其纯度以及分子量大小，结果如图4所示。由图4可知,随着分离纯化的逐步进行,各组分的电泳条带数越来越少,清晰度越来越高。亲和色谱是纯化的第一道工序,得到的蛋白质溶液是多种成分的混合体系,经离子交换色谱后,与蛋白分子质量标准对照,可看到,S3组分中至少存在2种蛋白,一种蛋白质的分子量约为97.2 kDa,另一种的分子量低于6.5 kDa。而凝胶过滤色谱后的G1组分只有1个清晰的条带,说明经分离纯化得到的抗菌蛋白已经达到电泳纯,以标准蛋白分子质量对数对它的相对迁移率(Rf)作图,绘制标准曲线(图5),由此计算出G1组分分子量约为4 kDa。

图4 小红豆抗菌蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE of the antifungal protein from small red beans注:1：小红豆蛋白粗提液;2：硫酸铵沉降分离液; 3：亲和蓝胶色谱A2组分;4：离子交换色谱S3组分; 5：凝胶过滤色谱G1组分;M：蛋白分子质量标准。

图5 标准蛋白分子质量曲线Fig.5 Standard curves for protein molecular weight

2.3 蛋白含量的测定结果

以25 g小红豆原材料为例,计算抗菌蛋白纯化过程中的每一步所得样品的蛋白含量,结果列于表1。由表1可知,25 g的小红豆种子经去皮后用缓冲液提取,约可得到粗蛋白溶液,随着分离纯化的逐步进行,蛋白质含量逐渐降低,一方面可能由操作造成损失,如缓冲液粗提时回收不完全、硫酸铵沉降离心后溶解不彻底等,另一方面蛋白质逐渐纯化,非目标产物被逐步移除,这是蛋白质含量减少的主要原因[21]。经凝胶过滤色谱后得到的目标蛋白含量为4.27 mg。

表1 小红豆抗真菌蛋白纯化过程中蛋白含量Table 1 Concentration of purification of antifungal protein from small red beans

2.4 抗真菌活性

小红豆抗真菌蛋白对来自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)均具有一定的抑制作用。采用琼脂片扩散法,若样品对真菌具有抑制作用,则表现为滤纸片周围的局部菌丝体生长受到抑制,出现半圆形月牙状的抑菌圈。小红豆蛋白的抗真菌活性实验结果见图6。

图6 小红豆抗真菌蛋白抑菌活性Fig.6 Inhibitory activity of the antifungal protein from small red beans注：A:空白对照8 μL无菌水;B:40 μg/μL抗菌蛋白无菌水溶液;C:20 μg/μL抗菌蛋白无菌水溶液。

由图6可以看出,在滤纸片B和C周围都出现了较为明显的抑菌圈,而A周围真菌的菌丝正常生长,没有出现半圆形抑菌圈。由此可见,小红豆纯化的抗菌蛋白对以上三种不同来源的真菌都表现出较强的抑制活性,且随着抗菌蛋白浓度的提高,月牙形抑菌圈也越来越明显。

3 结论

本研究通过缓冲液初提、硫酸铵分级沉降、亲和色谱、离子交换色谱及凝胶过滤色谱等步骤从小红豆中分离纯化出一种抗菌蛋白。对各分离纯化步骤得到的蛋白质同时进行SDS-PAGE电泳鉴定,对比观察发现,经凝胶过滤色谱后得到抗菌蛋白达到电泳纯,且相对分子质量约为4 kDa。通过纯化的小红豆抗菌蛋白对茄子尖孢镰刀菌、甜瓜尖孢镰刀菌及苦瓜尖孢镰刀菌的抗性实验证明小红豆抗菌蛋白具有较强的抗真菌活性。

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