气相色谱－串联质谱法测定水产品中五氯苯酚及其钠盐的残留量

朱晓华，王 凯，夏丽萍，梁 倩，孟 勇

（1．江苏省淡水水产研究所，水产质量检测中心，农业部渔业产品质量监督检验测试中心（南京），南京210017；2．谱尼测试集团股份有限公司，北京100080）

五氯苯酚（PCP）是一种有毒农药，曾在全球范围内被广泛用作除草剂、木材防腐剂和生物杀伤剂等，其钠盐形式－五氯酚钠（PCP－Na）在我国曾作为杀灭血吸虫中间宿主钉螺的药物和水产养殖过程中作清塘药物在水体大量使用［1］。PCP为环境荷尔蒙，微量即对人体有害［2］，美国环境保护署（EPA）、欧盟、加拿大等相继限制其使用［3－5］。我国农业部2002年发文明确规定了食品动物生产中禁用五氯酚钠。水产品中PCP及其钠盐残留量一直是近年政府监测的重点参数，结果显示，以往施用的PCPNa在环境中的残留［6］和个别渔民的违规使用对渔业产品的食品安全性造成一定的威胁。

关于PCP及其钠盐的测定方法主要有分光光度法［7］、毛细管区带电泳法［8］、免疫学方法［9－10］、气相色谱 法［1，11－20］、气 相 色 谱－质 谱 法［21－25］、液 相 色 谱法［26］及 液 相 色 谱－质 谱 法［27－28］，主 要 涉 及 水 质、土壤、木材和皮革等。目前水产品中五氯苯酚及其钠盐的主要测定方法为气相色谱法，在实际检测过程中发现水产品基质复杂，对目标峰有干扰，同时前处理方法均采用碳酸钾溶液反萃取净化，因两相性质差异大，如河蟹等高脂、高蛋白的样品在两相之间会形成严重的乳化，造成回收率低，定量不准确。本工作通过固相萃取前处理方法和负化学离子源下二级质谱检测参数的研究，建立了水产品中五氯苯酚（PCP）及其钠盐残留量的固相萃取－气相色谱－串联质谱法，以13C6－PCP作为内标物进行定量。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Thermo Fisher TSQ－45000Quantun型气相色谱－串联质谱仪；12通道固相萃取装置；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60mg／3mL）；AE 200型电子天平，感量0．000 1g；JY 5002型电子天平，感量0．01g；AllegraTM21R型台式高速冷冻离心机；XW－80A微型涡旋混合仪；DK－8D型数显恒温水浴锅。

PCP及13C6－PCP标准储备溶液：称取 PCP标准品（纯度99．0%）、13C6－PCP标准品（纯度99．0%）各0．010 0g，分别用0．1mol·L－1碳酸钾溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，配制成100μg·L－1标准储备溶液，于4℃冰箱中保存。

正己烷、环己烷为色谱纯；乙酸酐、硫酸、碳酸钾、无水硫酸钠均为分析纯。

1．2 仪器工作条件

1）色谱条件 TR－5MS色谱柱（30m×0．25mm，0．25μm）；进样口温度250 ℃；载气为99．999%高纯氦气；流量1．0mL·min－1；进样量1μL；不分流进样。柱升温程序：初始温度140℃，保持2min；以10℃·min－1速率升温至240℃，保持2min；再以35℃·min－1速率升温至280℃，保持5min。

2）质谱条件 负化学离子（NCI）源，离子源温度150℃；选择反应监测（SRM）模式；灯丝电流100μA；传输线温度250℃；反应气为甲烷；五氯苯乙酸酯（PCP－OAc）母离子m／z 307．7，子离子 m／z 233．1，265．7，定量离子 m／z 265．7，碰 撞 能量8V；13C6－PCP－OAc母离子m／z313．8，子离子m／z 238．8，271．4，定量离子m／z271．4，碰撞能量8V。

1．3 试验方法

1．3．1 样品制备

选用河蟹、鳕鱼为样品，河蟹去壳去鳃取可食部分，鱼取鱼皮与肌肉部分，用高速万能试样粉碎机打成匀浆，于－20℃冰箱中冷冻贮存。

1．3．2 样品前处理

测定前将样品室温解冻，称取混合均匀的样品1．000 0g于50mL具塞离心管中，加入1 000μg·L－1的 内 标13C6－PCP 50μL（添 加 质 量 分 数 为50．0μg·kg－1），加入硫酸（1＋1）溶液8mL，涡旋混匀，于80℃水浴加热30min，冷却至室温后，加入正己烷10mL，涡旋2min，以8 000r·min－1转速离心10min，重复加正己烷10mL提取1次，合并正己烷。使用HLB固相萃取小柱净化，依次用乙酸乙酯3mL、乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL活化小柱，转移样品提取液至HLB固相萃取小柱中，待上样液流出后，用乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL淋洗，甲醇3mL洗脱，接收洗脱液于15mL玻璃管中，于40℃下氮气吹干，用0．1mol·L－1碳酸钾溶液5mL溶解。将待衍生溶液于40～50℃水浴中加热10min，加入乙酸酐0．2mL，取出涡旋3min并不断放气，加正己烷2．5mL萃取，萃取液置于5mL容量瓶中，再加正己烷2．0mL重复萃取1次，合并萃取液，定容至5mL，加入少量无水硫酸钠脱水，溶液移入进样瓶，按仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

PCP 的 衍生物 PCP－OAc和13C6－PCP 的衍生物13C6－PCP－OAc的总离子流色谱图见图1。

2．2 固相萃取柱的选择与净化方法的建立

图1 PCP－OAc和13C6－PCP－OAc的总离子流色谱图Fig．1 TIC chromatograms of PCP－OAc and 13C6－PCP－OAc

正己烷极性相对较小，提取出的脂类与未沉淀的蛋白相对较多，采用碳酸钾溶液萃取净化时，两相性质差异大，在处理河蟹等高脂、高蛋白的样品时会形成严重的乳化［1，11－14］，从底部分层操作困难，造成回收率低，定量不准确。试验比较了中性氧化铝、弗罗里硅和HLB等3种小柱的净化效果。结果表明：中性氧化铝小柱、弗罗里硅小柱不能完全负载所有药物，对于高脂样品除脂肪效果不理想，试验选择采用HLB固相萃取小柱。

试验进一步比较了不同淋洗液、洗脱液体积对PCP回收率的影响，操作步骤为：空白河蟹样品（1．000 0g）在硫酸（1＋1）溶液8mL中于80℃水浴加热30min，用正己烷10mL提取2次，合并提取液；在提取液中加入标准储备溶液，使样品中PCP质量分数分别为5．0，10．0，20．0μg·kg－1；依次用乙酸乙酯3mL，乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液或乙酸乙酯－正己烷（1＋9）混合液3mL活化小柱，移取提取液至小柱，用乙酸乙酯－正己烷（1＋19）（淋洗液1）或乙酸乙酯－正己烷（1＋9）混合液（淋洗液2）3mL淋洗，用甲醇洗脱，分2段收集洗脱液，每段收集流出液3mL。每个阶段平行测定6次，采用文献［1］报道的气相色谱外标法定量，结果见表1。

表1 固相萃取小柱淋洗与洗脱条件比较（n＝6）Tab．1 Comparison of leaching and elution conditions of solid phase extraction column（n＝6）

由表1可知：对于1．000 0g空白河蟹样品，试验选用淋洗液1，即乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL淋洗，甲醇3mL洗脱，效果较好。

2．3 质谱条件的选择

试验分别比较了电子轰击离子（EI）源和NCI源下PCP的响应值，结果表明：NCI源下PCP的衍生物PCP－OAc的响应值比EI源下的响应值高数10倍，且抗干扰能力强，试验选择采用NCI源对PCP进行测定。

将200．0μg·L－1PCP标准溶液和13C6－PCP标准溶液在色谱条件下，用全扫描方式进行分析，根据PCP离子和13C6－PCP离子强度大小，选定检测母离子；比较离子源温度150，180，200，250℃下母离子强度，选定离子源温度；设置碰撞能量水平（3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33V）对选定的母离子进行轰击，并以子离子全扫描模式监测，初步确定碰撞能量水平范围，再设置碰撞能量水平（6，7，8，9V）对选定的母离子进行轰击，选择2个响应值高、质荷比大的特征子离子碎片，其中响应值高的子离子确定为SRM模式下的定量离子，另一个为定性离子。结果表明：离子源温度150℃下母离子响应最强，试验选定检测离子源温度为150 ℃；PCP－OAc母离子m／z307．7，子离子m／z233．1，265．7，定量离子m／z265．7，碰撞能量为8V；13C6－PCP－OAc母离子m／z313．8，子离子m／z238．8，271．4，定量离子m／z271．4，碰撞能量为8V。

2．4 工作曲线与检出限

将PCP与13C6－PCP标准储备溶液用0．1mol·L－1碳酸钾溶液稀释，配制成PCP的质量浓度分别为0．20，1．00，2．00，4．00，10．0，20．0μg·L－1，13C6－PCP的质量浓度为10．0μg·L－1的标准工作溶液系列，按照试验方法衍生后进行测定，以PCP的质量浓度为横坐标，PCP与内标13C6－PCP的定量离子峰的面积比为纵坐标绘制工作曲线。结果表明：PCP的质量浓度在0．20～20．0μg·L－1内呈线性，线性回归方程为y＝0．095x＋0．013，相关系数为0．999 5。

当空白河蟹、鳕鱼样品中添加水平为1．00μg·kg－1时，各样品检测离子中响应最低离子的信噪比均不小于3，由此得方法的检出限（3S／N）为1．0μg·kg－1。

2．5 精密度和回收试验

在1．000 0g空白河蟹、鳕鱼样品中分别添加10．0μg·L－1PCP标准溶液100μL，100μg·L－1PCP标准溶液50，100μL和500μg·L－1PCP标准溶液100μL（添加水平分别相当于PCP的质量分数为1．0，5．0，10．0，50．0μg·kg－1），在每个样品中添 加 1 000μg·L－1的13C6－PCP 标 准 溶 液50μL（质量分数为50．0μg·kg－1），每个添加水平平行测定6次，内标法定量，计算PCP的加标回收率和相对标准偏差（RSD），其结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：内标法测定PCP的加标回收率为78．0%～104%，RSD在2．0%～12%之间，说明方法具有较好的重复性，内标法定量也进一步提高了测定的稳定性，解决了外标法对前处理操作严格的问题。

2．6 标准储备溶液的稳定性

将100mg·L－1五氯苯酚标准储备溶液、100μg·L－1五氯苯酚标准溶液避光于4℃冷藏保存3个月，1个月后稀释至10μg·L－1，使用文献［1］的方法测定其峰面积，与当天配制的相同质量浓度溶液的峰面积进行比较，以评估标准溶液的稳定性。经Grubbs检验，数据具有一致性，无离群值。结果表明：100mg·L－1五氯苯酚标准储备溶液至少可以在4℃避光存放3个月，100μg·L－1五氯苯酚标准溶液至少可以在4℃避光存放1个月。

本工作通过对固相萃取前处理方法和二级质谱检测参数的研究，建立了测定水产品中五氯苯酚（PCP）及其钠盐残留量的固相萃取－气相色谱－串联质谱法。前处理方法使用HLB固相萃取柱净化，解决了前处理过程液液萃取净化方法的乳化现象而造成回收率低的问题。该方法使用NCI源，通过13C6－PCP作为内标物定量，SRM模式进行质谱测定，实现水产品中五氯苯酚及其钠盐残留量的定量与定性。检出限、线性关系、回收率和重现性等方法学指标均能满足水产样品中五氯苯酚及其钠盐残留量的测定。

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