促红细胞生成素肝细胞激酶受体及配体对骨改建的调控作用

徐晓南，张 丁

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院口腔科，北京 100730

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：294-298

骨改建是体内骨吸收和骨形成有序发生的生理过程，包括破骨细胞活化、骨吸收、逆转和骨形成4个阶段[1]。成骨细胞和破骨细胞间的耦连作用被认为是此过程的重要机制，目前对核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子受体/骨保护信号系统[2- 4]认识最为深入，近几年有学者提出促红细胞生成素肝细胞激酶受体及其配体(erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor and ephrin ligand，Eph/ephrin)双向信号通路在成骨、破骨细胞耦连活动中亦有重要的调控作用。本文就Eph家族蛋白的分子结构、信号转导机制，及其调控骨改建、牙槽骨改建方面进行阐述。

Eph受体和ephrin配体的结构

酪氨酸激酶受体是将细胞外刺激信息转变为生物学信号的关键分子，其中Eph受体是酪氨酸激酶受体家族中的最大亚族[5]，1987年，Hirai等[6]从肝癌细胞系中克隆出Eph受体的第一个成员EphA1，至今在人类基因组中已发现Eph家族蛋白的14种受体：EphA(A1- A8)、EphB(B1-B6)，8种配体：ephrinA(A1-A5)、ephrinB(B1-B3)[7- 8]。

Eph受体是一种I型跨膜糖蛋白，根据其亲和力和序列的保守性分为EphA和EphB，均包括胞外区、胞质区和跨膜区。球状胞外区可与配体特异性结合[9]，胞质区与信号传导密切相关[10]。ephrin配体分为两个亚型ephrinA和ephrinB，ephrinA通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上；横跨膜的ephrinB胞内区有磷酸化位点及Src同源性(SH2)结构域参与信号传导[11]。

Eph/ephrin双向信号传导

通常在一个亚族内，ephrin配体可与多个受体以不同亲和力交叉结合发挥作用[12]，但有的结合跨越了亚族的界限，例如ephrinA5与EphB2结合[13]，EphA4可被ephrinB2和ephrinB3激活。

Eph受体及ephrin配体介导的信号传导必须依赖于细胞间的接触[14]。ephrin配体激活Eph受体，正向调节细胞生物学效应为“正向信号传导”。Eph受体激活ephrin配体，逆向调节细胞反应为“反向信号传导”[15]。正、反向信号皆可通过酪氨酸磷酸化依赖或非依赖转导途径，向细胞内传递[16- 17]。有研究表明Eph/ephrin信号也独立地和细胞表面的其他信号系统(细胞表面蛋白、黏附分子、细胞表面通道等)相互作用，诱导错综复杂的生理反应[18]。

Eph/ephrin在骨改建过程中的调控作用

Eph受体和ephrin配体的相互作用可以影响细胞的黏附、迁移和增殖，参与细胞间的多种细胞学反应，在胚胎形成、神经发育、血管形成、免疫功能和激素调节、肿瘤形成等方面都有重要作用[19- 23]。有研究Eph/ephrin双向信号参与调控骨改建过程，EphB/ephrinB可以影响发育中骨骼的形态[24]，ephrinA4配体与软骨的发育有关[25]，目前对EphB4/ephrinB2和EphA2/ephrinA2在骨改建过程中的双向调控作用研究较深。

EphB4/ephrinB22006年，Zhao等[26]在体外实验中发现破骨细胞上ephrinB2配体介导的反向信号可抑制破骨细胞的形成，且抑制程度与EphB4受体成剂量依赖性，通过功能获得及功能缺失实验证明反向信号传导是通过ephrinB2羟基端YKV基序与胞浆内含PDZ结构域的蛋白质相互作用，激活下游转导信号，抑制c-Fos-核因子的活化T细胞c1转录级联反应(负反馈)，从而抑制破骨细胞的分化。也有研究显示核因子κB受体活化因子配体诱导的Raw264.7分化过程中，EphB4/ephrinB2反向信号负向调控Dvl2蛋白的表达，Dvl是参与ephrinB2下游信号转导途径的潜在PDZ结构域蛋白分子[10]。在体内实验中，敲除Efnb2(编码ephrinB2配体)基因的小鼠破骨细胞分化强，但其骨组织表型与野生型小鼠无差异[26]。Zhao等[26]认为这可能是因为在破骨细胞分化过程中，ephrinB1介导的反向信号和ephrinB2相似或者有其他的补偿因子可以维持体内的骨平衡。有研究表明破骨细胞表达的ephrinB1可以负向调控骨吸收，在炎症状态骨改建过程中ephrinB2功能缺失可以被有效地补偿[27- 29]。但Allan等[30]认为可能是成骨细胞自身间EphB4/ephrinB2信号传导的影响，他在研究中发现甲状旁腺素和相关蛋白能诱导成骨细胞中ephrinB2的表达，诱导成骨细胞分化和骨形成。

EphB4受体介导的正向信号可以增强成骨细胞的分化，促进骨形成，抑制骨吸收[26，31]。EphB受体位于调节级联反应的上游，可与多种信号通路相互作用，经Src、PI3K-Akt、Ras/Rho蛋白等传递信号影响细胞分化[32- 33]。有研究表明EphB4促进成骨细胞分化主要通过加强细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)l/2磷酸化和抑制RhoA的活性完成[26，34- 36]，但具体的作用原理有待于进一步遗传学研究。

EphA2/ephrinA2Irie等[11]在成骨细胞和破骨细胞表面均检测到EphA2、ephrinA2的表达，破骨前体细胞过表达ephrinA2时骨缺损面积大于野生型对照组，ephrinA2的反向信号可以显著促进破骨细胞形成，在实验中，核因子κB受体活化因子配体在破骨细胞前体中能诱导ephrinA2的表达，此过程ephrinA2的早期诱导是c-Fos依赖性的，并不依赖于活化的T细胞核因子c1，荧光素报告基因显示，ephrinA2基因片段的1.6 kb上游区域可被c-Fos-c-Jun激活，但c-Fos是否直接与ephrinA2结合需要进一步分析研究。Irie等[11]在细胞共培养实验中发现敲除EphA2基因的成骨细胞分化能力明显高于正常成骨细胞，表明EphA2/ephrinA2可以抑制成骨细胞分化，Irie认为可能是EphA2的正向信号激活了RhoA，发挥抑制成骨细胞分化的效应。Sun等[37]提出破骨细胞外泌体高表达miR-214，通过EphA2-ephrinA2信号途径抑制成骨效应，Yan和Ye[38]研究显示雌激素也可以通过影响EphA2/ephrinA2信号抑制破骨细胞分化。目前国内外学者认识到在骨改建的初期，EphA2/ephrinA2的相互作用可以促进骨吸收，同时抑制成骨细胞形成[10，34，39]，其作用与骨改建过渡期EphB4/ephrinB2抑制破骨细胞形成促进骨生成的双向作用相反，但其影响因素、分子机制仍不明确。

Eph/ephrin在牙槽骨改建中的作用

力学刺激下Eph/ephrin在牙槽骨改建过程中的作用正畸过程中牙齿移动的组织学基础是牙周膜和牙槽骨的改建[40]，牙周膜是怎样将力学信号转变为生物化学信号，引起进一步骨改建，目前尚未完全清楚。有学者在上皮细胞中发现力学刺激可以影响Eph受体和ephrin配体的表达和功能，改变细胞外基质和细胞骨架[41]，Eph/ephrin是否参与正畸力引起的骨改建过程也是目前研究的热点。

Diercke等[42]证明牙周膜成纤维细胞受到压应力后，成纤维细胞间、成纤维细胞和成骨细胞间都可以通过EphA2/ephrinA2的相互作用抑制成骨细胞分化，减少骨形成。国内学者Hou等[43]发现周期性压应力可以引起破骨细胞分化促进骨吸收，抑制骨形成，在破骨细胞分化过程中牙周膜成纤维细胞和破骨细胞上ephrinB2的表达增强，而成骨细胞上EphB4和ephrinB2的表达减弱，从而促进抑制成骨细胞分化，促进骨吸收。当牙周膜细胞受到拉应力时，EphB4/ephrinB2信号转导通路可以促进成骨向转录因子的表达，促进骨形成。Dierke等[44]发现牙周膜成纤维细胞初受拉力后，ephrinB2表达增加，24 h达到高峰，而EphB4表达的改变并不显著；牙槽骨的成骨细胞受到拉应力后，ephrinB2表达水平在1 h出现短暂的升高后又降低，表明在牙槽骨改建初期，成骨细胞间的旁分泌调节先发生，牙周膜成纤维细胞和成骨细胞间的相互作用在之后可以持续发生。

有学者提出压应力介导的EphA2/ephrinA2信号通路中Ras、ERK1/2是重要调控蛋白[45]，上游蛋白Ras可以使ERK1/2磷酸化，激活转录因子c-Fos和Ap-1，减少成骨细胞特异性转录因子的表达，抑制成骨细胞分化。ERK1/2是将细胞表面受到的力学刺激信号传导至细胞核的关键，Ap- 1是c-fos和c-jun组成的二聚体[46]。实验还推测EphB4/ephrinB2介导的这种力学传导可能是通过局部黏着斑激酶的再分布，Ras、ERK1/2的磷酸化激活转录因子Sp1完成，但是具体的分子机制尚不清楚[44]。

炎症环境下Eph/ephrin在牙槽骨改建过程中的作用口腔常见疾病牙周炎是成人牙齿缺失的主要原因，组织学表现为牙周结缔组织的破坏、牙槽骨吸收，Eph/ephrin是否参与这一炎症状态下的骨吸收过程成为越来越多学者的研究内容。2006年有学者提出，在炎症反应中，Eph/ephrin能松懈内皮或上皮屏障，促进白细胞的渗透和向组织的迁徙[47]。用细菌内毒素脂多糖和炎症因子如白细胞介素-1b，肿瘤坏死因子-α对内皮细胞进行培养，ephrinA1被发现是早期刺激应答的产物，接着ephrinA5和ephrinB1及其受体EphA2和EphA3的表达也会上调[47- 48]。Gao等[49]通过体外实验发现牙周病致病菌牙龈卟啉单胞菌的脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide，Pg-LPS)可以上调EphA2的表达，促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞分化，实验中还发现在破骨细胞分化过程中，Pg-LPS可以促进其他破骨相关基因的表达，如ACP5、MMP9、c-fos、NFATc1、CtsK，由此作者推测Pg-LPS调控EphA2表达的机制可能与Toll样受体及其信号有关。同期国内学者Wang等[29]在动物实验中发现在炎症微环境中EphB4的表达减少，抑制成骨活性，促进破骨细胞分化，延迟牙槽骨再生，在炎症环境下阻断ephrinB2配体的表达，并不影响骨改建和骨再生的情况，作者认为在炎症状态下存在其他信号因子可以补偿ephrinB2的功能，与Zhao等[26]观点一致。对炎症环境下Eph/ephrin在牙槽骨改建中作用的研究刚刚起步，其具体的作用机制也只是推测阶段，需要更多更完善的体内外实验深入研究。

综上，随着生物分子技术的发展，Eph家族蛋白已迅速成为酪氨酸激酶受体的最大亚族，近几年对其在骨组织领域的作用研究越来越多，目前已初步证实Eph/ephrin双向传导参与骨改建过程，对成骨、破骨细胞耦连活动亦有重要的调控作用，但大多数研究对其具体机制只处于推测阶段，与下游信号传导关系尚不明确，怎样与其他信号通路交叉作用也不清楚。此外，病理状态如骨来源肿瘤、炎症环境下对Eph家族蛋白的表达情况、激活途径及下游通路应该进一步深入研究，为治疗相关疾病寻找新靶点，可构建骨组织工程新型种子细胞，利用现代生物分子技术将Eph家族蛋白制成靶向治疗药物，为骨质疏松、骨硬化、牙周炎等患者的治疗提供新方法、新思路。

[1] McArdle A，Marecic O，Tevlin R，et al. The role and regulation of osteoclasts in normal bone homeostasis and in response to injury[J]. Plast Reconstr Surg，2015，135(3)：808- 816. DOI：10.1097/PRS.0000000000000963.

[2] O’Brien CA，Nakashima T，Takayanagi H. Osteocyte control of osteoclastogenesis[J]. Bone，2013，54(2)：258- 263. DOI：10.1016/j.bone.2012.08.121.

[3] Tanaka H，Mine T，Ogasa H，et al. Expression of RANKL/OPG during bone remodelinginvivo[J]. Biochem Biophys Res Commun，2011，411(4)：690-694. DOI：10.1016/j.bbrc.2011.07.001.

[4] Hanada R，Hanada T，Sigl V，et al. RANKL/RANK-beyond bones[J]. J Mol Med，2011，89(7)：647- 656. DOI：10.1007/s00109- 011- 0749-z.

[5] Schlessinger J. Receptor tyrosine kinases：legacy of the first two decades[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol，2014，6(3)：a008912. DOI：10.1101/cshperspect.a008912.

[6] Hirai H，Maru Y，Hagiwara K，et al. A novel putative tyrosine kinase receptor encoded by the eph gene[J]. Science，1987，238(4834)：1717.

[7] Pitulescu ME，Adams RH. Eph/ephrin molecules-a hub for signaling and endocytosis[J]. Genes Dev，2010，24(22)：2480- 2492. DOI：10.1101/gad.1973910.

[8] Egea J，Klein R. Bidirectional Eph-ephrin signaling during axon guidance[J]. Trends Cell Biol，2007，17(5)：230- 238. DOI：10.1016/j.tcb.2007.03.004.

[9] Matsuo K，Otaki N. Bone cell interactions through Eph/ephrin：bone modeling，remodeling and associated diseases[J]. Cell Adh Migr，2012，6(2)：148- 156. DOI：10.4161/cam.20888.

[10] Mao Y，Huang X，Zhao J，et al. Preliminary identification of potential PDZ-domain proteins downstream of ephrin B2 during osteoclast differentiation of RAW264.7 cells[J]. Int J Mol Med，2011，27(5)：669-677. DOI：10.3892/ijmm.2011.639.

[11] Irie N，Takada Y，Watanabe Y，et al. Bidirectional signaling through EphrinA2-EphA2 enhances osteoclastogenesis and suppresses osteoblastogenesis[J]. J Biol Chem，2009，284(21)：14637- 14644. DOI：10.1074/jbc.M807598200.

[12] Cunningham F，Amode MR，Barrell D，et al. Ensembl 2015[J]. Nucleic Acids Res，2015，43(Database issue)：D662-D669. DOI：10.1093/nar/gku1010.

[13] Kania A，Klein R. Mechanisms of ephrin-Eph signalling in development，physiology and disease[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2016，17(4)：240- 256. DOI：10.1038/nrm.2015.16.

[14] Barquilla A，Pasquale EB. Eph receptors and ephrins：therapeutic opportunities[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol，2015，55(55)：465- 487. DOI：10.1146/annurev-pharmtox- 011112- 140226.

[15] Arthur A，Zannettino A，Panagopoulos R，et al. EphB/ephrin-B interactions mediate human MSC attachment，migration and osteochondral differentiation[J]. Bone，2011，48(3)：533- 542. DOI：10.1016/j.bone.2010.10.180.

[16] Himanen JP，Nikolov DB. Eph signaling：a structural view[J]. Trends Neurosci，2003，26(1)：46- 51. DOI：https：//doi.org/10.1016/S0166- 2236(02)00005-X.

[17] Cheng N，Chen J. Tumor necrosis factor-alpha induction of endothelial ephrin A1 expression is mediated by a p38 MAPK-and SAPK/JNK-dependent but nuclear factor-kappa B-independent mechanism[J]. J Biol Chem，2001，276(17)：13771- 13777. DOI：10.1074/jbc.M009147200.

[18] 常志永，赵建宁，包倪荣，等. Eph-ephrin双向信号功能的研究进展[J]. 中国病理生理杂志，2013，29(3)：560- 564. DOI：10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.03.032.

[19] Zou JX，Wang B，Kalo MS，et al. An Eph receptor regulates integrin activity through R-Ras[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：13813-13818.DOI：https：//doi.org/10.1073/pnas.96.24.13813.

[20] Paixão S，Balijepalli A，Serradj N，et al. EphrinB3/EphA4-mediated guidance of ascending and descending spinal tracts[J]. Neuron，2013，80(6)：1407-1420. DOI：10.1016/j.neuron.2013.10.006.

[21] Sharfe N，Nikolic M，Cimpeon L，et al. EphA and ephrin-A proteins regulate integrin-mediated T lymphocyte interactions[J]. Mol Immunol，2008，45(5)：1208- 1220. DOI：10.1016/j.molimm.2007.09.019.

[22] Martiny-Baron G，Holzer P，Billy E，et al. The small molecule specific EphB4 kinase inhibitor NVP-BHG712 inhibits VEGF driven angiogenesis[J]. Angiogenesis，2010，13(3)：259- 267. DOI：10.1007/s10456- 010- 9183-z.

[23] Li M，Wang B，Wu Z，et al. A novel recombinant protein of ephrinA1-PE38/GM-CSF activate dendritic cells vaccine in rats with glioma[J]. Tumour Biol，2015，36(7)：5497- 5503. DOI：10.1007/s13277- 015- 3217- 5.

[24] Compagni A，Logan M，Klein R，et al. Control of skeletal patterning by ephrinB1-EphB interactions[J]. Dev Cell，2003，5(2)：217-230. DOI：https：//doi.org/10.1016/S1534- 5807(03)00198- 9.

[25] Abdou AG，Abd el-Wahed MM，Asaad NY，et al. Ephrin A4 expression in osteosarcoma，impact on prognosis，and patient outcome[J]. Indian J Cancer，2010，47(1)：46- 52. DOI：10.4103/0019- 509X.58859.

[26] Zhao C，Irie N，Takada Y，et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis[J]. Cell Metab，2006，4(2)：111- 121. DOI：10.1016/j.cmet.2006.05.012.

[27] Cheng SH，Zhao SL，Nelson B，et al. Targeted disruption of Ephrin B1 in cells of myeloid lineage increases osteoclast differentiation and bone resorption in mice[J]. PLoS One，2012，7(3)：e32887. DOI：10.1371/journal.pone.0032887.

[28] Cheng S，Kesavan C，Mohan S，et al. Transgenic overexpression of ephrin b1 in bone cells promotes bone formation and an anabolic response to mechanical loading in mice[J]. PLoS One，2013，8(7)：e69051. DOI：10.1371/journal.pone.0069051.

[29] Wang L，Zhang J，Wang C，et al. Low concentrations of TNF-α promote osteogenic differentiation via activation of the ephrinB2-EphB4 signalling pathway[J]. Cell Prolif，2017，50(1)：e12311. DOI：https：//doi.org/10.1111/cpr.12311：6430407.

[30] Allan EH，Häusler KD，Wei T，et al. EphrinB2 regulation by PTH and PTHrP revealed by molecular profiling in differentiating osteoblasts[J]. J Bone Miner Res，2008，23(8)：1170- 1181. DOI：10.1359/jbmr.080324.

[31] Martin TJ，Allan EH，Ho PW，et al. Communication between ephrinB2 and EphB4 within the osteoblast lineage[J]. Adv Exp Med Biol，2010，658(9)：51- 60. DOI：10.1007/978- 1- 4419- 1050- 9_6.

[32] Pasquale EB. Eph receptors and ephrins in cancer：bidirectional signalling and beyond[J]. Nat Rev Cancer，2010，10(3)：165- 180. DOI：10.1038/nrc2806.

[33] Jørgensen C，Sherman A，Chen GI，et al. Cell-specific information processing in segregating populations of Eph receptor ephrin-expressing cells[J].Science，2009，326(5959)：1502- 1509. DOI：10.1126/science.1176615.

[34] Matsuo K，Otaki N. Bone cell interactions through Eph/ephrin：bone modeling，remodeling and associated diseases[J]. Cell Adh Migr，2012，6(2)：148- 156. DOI：10.4161/cam.20888.

[35] Aslam MI，Abraham J，Mansoor A，et al. PDGFRβ reverses EphB4 signaling in alveolar rhabdomyosarcoma[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(17)：6383- 6388. DOI：10.1073/pnas.1403608111.

[36] Park EC，Cho GS，Kim GH，et al. The involvement of Eph-Ephrin signaling in tissue separation and convergence during Xenopus gastrulation movements[J]. Dev Biol，2011，350(2)：441- 450. DOI：10.1016/j.ydbio.2010.12.012.

[37] Sun W，Zhao C，Li Y，et al. Osteoclast-derived microRNA-containing exosomes selectively inhibit osteoblast activity[J]. Cell Discovery，2016，2(4)：16015. DOI：10.1038/celldisc.2016.15.

[38] Yan X，Ye TW. Early molecular responses of bone to estrogen deficiency induced by ovariectomy in rats[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8(4)：5470- 5477.DOI：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4483909/.

[39] Arvidson K，Abdallah BM，Applegate LA，et al. Bone regeneration and stem cells[J]. J Cell Mol Med，2011，15(4)：718- 746. DOI：10.1111/j.1582- 4934.2010.01224.x.

[40] Murshid SA. The role of osteocytes during experimental orthodontic tooth movement：a review[J]. Arch Oral Biol，2017，73(1)：25-33.DOI：10.1016/j.archoralbio.2016.09.001.

[41] Obi S，Yamamoto K，Shimizu N，et al. Fluid shear stress induces arterial differentiation of endothelial progenitor cells[J]. J Appl Physiol，2009，106(1)：203- 211. DOI：10.1152/japplphysiol.00197.2008.

[42] Diercke K，Sen S，Kohl A，et al. Compression-dependent up-regulation of ephrin-A2 in PDL fibroblasts attenuates osteogenesis[J]. J Dent Res，2011，90(9)：1108- 1115. DOI：10.1177/0022034511413926.

[43] Hou J，Chen Y，Meng X，et al. Compressive force regulates ephrinB2 and EphB4 in osteoblasts and osteoclasts contributing to alveolar bone resorption during experimental tooth movement[J]. Korean J Orthod，2014，44(6)：320- 329. DOI：10.4041/kjod.2014.44.6.320.

[44] Diercke K，Kohl A，Lux CJ，et al. Strain-dependent up-regulation of Ephrin-B2 protein in periodontal ligament fibroblasts contributes to osteogenesis during tooth movement[J]. J Biol Chem，2011，286(43)：37651- 37664. DOI：10.1074/jbc.M110.166900.

[45] Sen S，Diercke K，Zingler S，et al. Compression induces Ephrin-A2 in PDL fibroblasts via c-fos[J]. J Dent Res，2015，94(3)：464- 472. DOI：10.1177/0022034514567197.

[46] Yokoyama K，Hiyama A，Arai F，et al. C-Fos regulation by the MAPK and PKC pathways in intervertebral disc cells[J]. PLoS One，2013，8(9)：e73210. DOI：10.1371/journal.pone.0073210.

[47] Funk SD，Yurdagul A，Albert P，et al. EphA2 activation promotes the endothelial cell inflammatory response：a potential role in atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(3)：686-695. DOI：10.1161/ATVBAHA.111.242792.

[48] Hafner C，Meyer S，Langmann T，et al. Ephrin-B2 is differentially expressed in the intestinal epithelium in Crohn’s disease and contributes to accelerated epithelial wound healinginvitro[J]. World J Gastroenterol，2005，11(26)：4024- 4031. DOI：10.3748/wjg.v11.i26.4024.

[49] Gao A，Wang X，Yu H，et al. Effect of porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS) on the expression of EphA2 in osteoblasts and osteoclasts[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2016，52(2)：228- 234. DOI：10.1007/s11626- 015- 9965- 0.