“动物法则”在烈性传染病防治药物和生物制品开发中的应用

高 明,焦 磊,王秉翔

“动物法则”(animal rule)[1]是美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)在药品和生物制品审批法规中,针对旨在减少或防止因暴露于生物、化学、放射性核物质造成的严重或威胁生命的疾病的药物和生物制品欲获得上市,出于伦理道德和不可操作性而无法直接在人体进行产品有效性研究等原因,特别制定的以该产品动物试验有效性数据证明其人体有效性为主要依据的操作原则.动物法则没有一定之规,视不同类别、不同疾病制定不同策略、不同路径,关键在于可操作性、可说服性.此法则于2002年5月正式生效,是美国应对生物恐怖袭击的有效策略之一.炭疽[2]、鼠疫[3]、肉毒菌毒素中毒[4]等疾病,均属于“动物法则”所指的生物因素造成的疾病,它们的病原菌具有毒性强、传染性强、抵抗力强等特点,常以易于吸入的气溶胶状态进行传播和扩散,长期以来被“恐怖分子”作为生物战剂研究和使用,尤其是炭疽.鉴于此类疾病的特性,出于伦理道德和不可操作性等原因,无法直接在人体进行产品的有效性研究.这种情况下,根据“动物法则”的规定,以充分且有严格对照的动物实验数据为依据,并结合人体的安全性数据,开发者便可向FDA提交药物和生物制品的上市审批申请.自“动物法则”生效以来,FDA批准的此类产品主要以防治炭疽的单克隆抗体为主,其次还有肉毒抗毒素,尚没有鼠疫相关的药物或生物制品.

1 FDA的要求与建议

1.1 上市前的要求 开发的产品需要满足以下几点要求,才能符合FDA的审批标准[1]:①对于化学、生物、放射性或核物质毒性的病理生理学机制有明确的了解,并且新产品可以预防或显著降低物质的毒性.②应在一种以上的动物模型中证明新产品有效,而且动物研究的结果可以证实该产品可能在人类产生临床效益.若只用一种动物模型,则该动物模型必须具有充分代表性,其反应特性已被充分评估可用于预测人类的反应性.③动物研究终点显然与人类期望的益处有关,通常是提高生存率或降低发病率.④根据药代动力学(pharmacokinetics,PK)和药效学(pharmacod-ynamics,PD)方面的种间差异、暴露－反应特性的应用以及其它动物和人体的相关数据,将动物药效研究的结果桥联到人,以便推算出适用于人体的有效剂量.

1.2 上市后的要求 新产品上市后,开发者仍需遵照以下几点要求[1]:①在伦理道德和可行性允许的范围内,继续追踪新产品的临床效果,并做好安全性评价.②FDA有权制定新产品的限制使用范围.③患者具有新产品审批信息的知情权,使用说明书必须告知患者该产品仅是以动物实验数据为依据制备的,并标明剂量、用药方式、副作用等相关信息.④开发者必须进行上市后销售及安全使用记录报告.此外,在“动物法则”规定之下,申请者若违背上市后的要求,FDA有权对审批的产品进行撤销.

1.3 动物模型的选择 研究发现,非人灵长类(non-human primates,NHP)在疾病发展进程和易感性等方面与人类相接近,最适合作为研究烈性传染病的动物模型,常见的有恒河猴、非洲绿猴子、食蟹猴等.Rossi CA等[5]将非洲绿猴暴露于炭疽杆菌芽胞中后,检测其体温、心率等生理参数,发现非洲绿猴具有和恒河猴及人类相似的疾病发展过程,是研究炭疽的有效动物模型.Henning LN等[6]通过记录每只动物暴露于致死剂量的炭疽杆菌芽胞后的临床特征,确定了食蟹猴可作为吸入性炭疽的治疗动物模型.相比于NHP的价格高、数量少、饲养要求高等条件,新西兰白兔等较小的哺乳动物具有易繁殖、来源便利、属系多样等特点,在研究药物的剂量、用法和疗程时也不失为合适的动物模型[7].Fellows P等[8]为了使r F1V鼠疫疫苗满足“动物法则”的许可要求,通过气溶胶暴露参数、临床症状的发病和严重程度、疾病的病理生理反应以及与人类疾病相关的资料,证明了瑞士韦伯斯特鼠疾病病理学与人类相似,可以作为肺鼠疫研究的有效动物模型.需要注意的是,无论选择何种动物,在研究开始前,开发者都应该与FDA讨论所选动物模型的功效试验和研究的细节,应该证明所选动物模型在未经治疗时暴露出的临床症状、血药浓度的极值、死后剖解的病理特征、毒素产物、靶器官、酶系统等方面,都与在人体内的相似.

1.4 桥联指标的分析 将动物结果桥联到人,需要注意以下几点:①应将未经治疗的动物与未经治疗的人类进行比较,包括临床症状、实验室参数、组织病理学、肉眼可见病症、发病率和死亡率.②致病因子暴露的途径应选择气雾吸入,以模拟人类有意释放时的情形.③使用的激发剂应该与引起人类疾病的病原体相一致,若不一致应作出解释说明.④要在开发的早期阶段确定药物消除的方式,并识别代谢产物[9].⑤给药后,要对新产品的PK谱特征进行描述,并将受影响动物的PK信息与健康动物的PK信息进行比较,以确定病原体引起的疾病或状况是否影响该产品的药代动力学.⑥动物模型中PK参数(药时曲线下面积AUC、血浆峰浓度Cmax、血浆谷浓度Cmin、稳态血药浓度CSS)和PD参数(疗效终点和潜在的生物标志物)之间的关系应该在至少3个剂量范围内被确定,并且在剂量范围的研究中确定暴露－反应曲线(E/R)的形状.⑦如果可能,建议获得特定人群(老年人、孕妇、肾或肝功能损害、儿童)的PK数据,用于研究在临床中联合用药时药物间相互作用的潜能.⑧动物研究必须遵守《动物福利法》(7U.S.Code.2131)和美国公共卫生服务政策中对动物模型人道关怀的相关法律法规.

FDA鼓励开发者就人类剂量选择的两种方法与FDA积极展开讨论.一种是在动物模型中确定PK/PD参数(最小抑菌浓度 MIC、Cmax/MIC、AUC/MIC),根据PK/PD参数来估计药物的靶浓度和活性.另一种方法是通过识别和使用适当的生物标志物.选择的生物标志物应该与药物预防或实质性减少病原体引起的疾病以及达到预期临床结果(降低死亡率或发病率)的机制有关,并对生物标志物的测定方法和性能特征进行描述.美中不足的是,药物暴露与有效性之间的关系是在动物体内建立的,生物标志物、AUC/MIC等方面的证据并不能表明这种关系可以预测人类有效的药物暴露.在这种情况下,合理的假设是人类的E/R关系类似于动物的E/R关系,可以基于对动物E/R的关系的了解,按上述方法选择人体剂量.

1.5 其他相关法规介绍 除了“动物法则”,美国国会和FDA在应对此类传染病方面还制定了很多法规,这些法规对利用“动物法则”进行产品开发具有很好的指导作用.1999年颁布的《国防授权法案》,授权总统可以在某些军事环境下放弃FDA知情同意的要求,缩短了药物应对生物恐怖袭击时的审批途径.1999年10月,FDA发布了一条新规则,指出当在人类进行有效性研究伦理上不可行时,需要有证据来证明新药和生物制品对致命或永久性致残的有毒物质的有效性,此规则被认为是“动物法则”的前身.2004年3月,FDA提出了“关键路径计划”,呼吁全社会共同参与创造新的、能更准确地判断和预测药物安全性及有效性的工具,促进生物研究的基础成果更快、更好地向临床应用转化.2007年11月,FDA和美国过敏与传染病研究所等机构主办炭疽疫苗研讨会,专门讨论将动物保护与人类免疫原性桥联起来的策略.2009年1月,FDA发布了“动物模型－动物(效应)法规下考察药效的基本要素”一文,作为开发者使用动物模型的指南.2013年,美国国会通过了《大流行和所有灾害的准备再授权法案》,明确了FDA的一项应对突发性事件的新职能:当在人体测试新药或生物制品的有效性不具有可行性或不道德时,FDA应加强与开发者的交流与合作,并建立与开发者之间的技术咨询会议机制,帮助新药和生物制品的开发.2015年10月,FDA发布了新一版的“医疗器械动物实验指南文件的征求意见稿”,指出动物试验须在符合药物非临床研究质量管理规范(good laboratory practice,GLP)的机构进行,否则必须向FDA说明其理由,并具体描述实际操作与GLP相关要求之间的差距.此外,在启动研究之前,开发者还应当确定GLP法规的例外情况,并寻求FDA同意的替代方法,以确保数据的质量和完整性.

2 近年来获批的药物及生物制品介绍

2.1 Bio Thrax Bio Thrax是由 Emergent BioSolutions公司开发的炭疽吸附疫苗,是第一款基于“动物法则”而获得FDA批准的疫苗,也是唯一经FDA许可的预防炭疽感染的疫苗.早在1970年,FDA批准Bio Thrax用于军事人员、兽医、动物毛发和兽皮加工者,以及实验室人员等在高风险环境下工作人群的暴露前预防(pre-exposure prophylaxis,Pr EP),免疫程序为6针次皮下注射,分别为0、2、4周和6、12、18月各接种一剂,此后每年加强一剂.后来,接种计划被多次调整,直到2012年改为0、1、6月的3针次肌肉注射,在12、18月加强免疫,此后每年注射一次[10].研究还发现,除了皮下注射和肌肉注射,通过鼻腔接种2剂次的Bio Thrax可以使A/J小鼠能对抗100倍LD50炭疽芽胞的攻击,表明鼻粘膜免疫也是炭疽的有效免疫方式[11].

“动物法则”被颁布后,2015年,FDA批准了Bio Thrax一项新的适应症,即与特定抗生素联用,用于疑似或确诊感染炭疽病例的暴露后预防(postexposure prophylaxis,PEP),免疫程序为0、2、4周进行3针次皮下注射,随后美国和德国将免疫程序改为0、1、6月进行3针次肌肉注射,三年后加强免疫一次.Bio Thrax用于PEP的有效性已经在多种动物模型中得到了验证[7]:①家兔PEP研究结果表明,暴露后接种Bio Thrax,存活率呈剂量依赖性增长.接种Bio Thrax和左氧氟沙星的一组存活率为100%,单独使用抗生素的一组存活率仅为23%.②兔子与食蟹猴的PEP研究结果显示,暴露后接种Bio Thrax将诱导剂量依赖性的中和抗体反应,且暴露后幸存者的毒素中和抗体水平是暴露前的10～250倍.

另外三项研究[12],检测了健康的18－65岁的成年人接种Bio Thrax之后,其体内抗体的产生情况以及安全性,并证明和环丙沙星合用不会产生不利影响.以上这些结果最终被用于支持Bio Thrax在“动物法则”下用于PEP的许可.Savransky V等进行的最新研究[13],以CpG 7909作为佐剂与Bio-Thrax配伍成AV7909疫苗,表明Cp G 7909可以增加炭疽毒素中和抗体水平的阈值,这也使得AV7909有望开发成为炭疽暴露后预防的下一代疫苗.

2.2 Raxibacumab Raxibacumab是由美国人类基因组科学公司(HGS)、美国卫生及人类服务部(H HS)和生物医学高级研究及发展管理局(BARDA)合作开发的单抗,也是首个基于“动物法则”批准的抗炭疽杆菌保护性抗原(PA)的人源性单抗,可以高亲和力的结合PA,特异性阻断PA与炭疽毒素受体结合,并抑制毒素介导的细胞死亡[14].尽管在获得FDA批准之前,美国根据国家战略储备计划(Strategic National Stockpile,SNS)和“生物盾”计划(Project Bioshield),已经采购了数万剂Raxibacumab作为战略储备,以满足应急情况下足够的药物数量.然而,Raxibacumab正式获得FDA批准上市的过程并不顺利.2009年11月,FDA以临床试验数据和分析数据不足为由拒绝了HGS公司提交的关于Raxibacumab的生物制品许可申请(Biologics License Application,BLA).此后,HGS公司针对问题进行了进一步的对比分析研究,并于2012年7月再次向FDA提交了Raxibacumab的BLA.直到2012年12月,FDA批准Raxibacumab与合适的抗菌药物联用,用于成人和儿童吸入性炭疽治疗,以及在替代疗法不可用或不适合的情况下作为吸入性炭疽的预防用药[15].

Raxibacumab之所以可以获得FDA的审批,凭借着动物模型中的有效性研究和人体的安全性评价方面的良好结果.动物模型中的研究包括暴露前预防和暴露后治疗吸入性炭疽[16-17],所选的动物模型主要为大鼠、新西兰白兔和食蟹猴.人体中进行的安全性研究[18],目的是评估健康人的安全性、耐受性和PK参数.研究还证明,在应对可能发生的炭疽暴发时,通过肌肉注射或皮下注射给药比静脉注射更有利于炭疽的防治.最近的比较发现[19],与单独使用抗生素可在暴露后4 d内可预防毒血症相比,将Raxibacumab与抗生素联合使用可以使超过80%的受试者的保护时间延长为暴露后7 d,即使在抗生素耐药的情况下,Raxibacumab也能提高至少6 d的保护作用.

2.3 HBAT 2013年3月,FDA根据“动物法则”批准加拿大Cangene公司开发的肉毒杆菌中毒7价抗毒素注射剂Equine-Derived Heptavalent Botulinum Antitoxin(HBAT),用于治疗有病史或疑有接触肉毒杆菌神经毒素后显示肉毒杆菌中毒征象的非婴儿患者.Yu PA等[20]所作的临床报告表明,HBAT对疑似或确诊肉毒中毒患者的耐受性良好,早期给药比晚期给药更有效,出现麻痹性疾病的病人在进行实验室确认之前,保持对肉毒杆菌中毒的临床怀疑是很重要的.在104例肉毒中毒确诊患者治疗过程中验证了HBAT的临床疗效,症状出现后2 d内应用HBAT治疗可缩短住院时间和重症监护时间,平均在2.4 d可以检测到肉毒中毒症状的改善,平均在4.8 d会有肌肉力量的改善.需要注意的是,HBAT在生产过程中会有胃蛋白酶、磷酸三丁酯和Triton X-100残留在成品中,每一种都有可能引起过敏反应,综合发生率为1%～2%,需要肾上腺素和抗组胺剂治疗,而且可能需要重症监护[21].

2.4 Anthrasil 2015年,FDA批准了Anthrasil与其他抗菌药物联用治疗吸入性炭疽.Anthrasil由加拿大Cangene公司生产,是获得FDA批准并纳入战略性国家储备的少数几种抗毒素药物之一,成分是静脉注射人炭疽免疫球蛋白(AIG-IV),由采集于Bio Thrax接种者的血浆制成,内含对抗PA的多克隆毒素中和抗体.在获得FDA审批之前,Anthrasil最大的临床应用是参与2009年～2010年英国的海洛因吸食者之间暴发的炭疽[22],美国也曾在2011年采购Anthrasil作为试验性药物用于战略储备,如需使用则要FDA紧急授权.

根据“动物法则”,Anthrasil的有效性已在动物模型被证明[23],安全性已在125名健康志愿者身上得到了评估[24],研究结果提供了Anthrasil获得FDA审批的充分证据.在新西兰白兔和食蟹猴中的疗效研究表明,Anthrasil可以增加炭疽感染动物的存活率,即使是在临床疾病发作后给药.动物模型中的研究中还发现,暴露后12 h接种Anthrasil,可以保护89%～100%的动物,而暴露后24 h接种Anthrasil会使生存率降为39%,这强调了早期干预的重要性.对Anthrasil进行PK分析,表明动物体内人抗PA抗体的衰减速度比在人体内更快,这就意味着必须给动物注射较高剂量的药物才能模拟人体的药物暴露,例如兔子及NHP在21mg/kg剂量时的效果与人体剂量为7mg/kg时的效果相类似[24].

2.5 Anthim 2016年,FDA批准Anthim注射液与特定抗生素联用,治疗成人和儿童的吸入性炭疽感染,以及在不适合替代疗法时预防吸入性炭疽热.Anthim是一种嵌合免疫球蛋白G1(k)单克隆抗体,结合并中和PA,在炭疽毒素装配和靶细胞中毒中起核心作用.Anthim与左氧氟沙星、环丙沙星、多西环素合用治疗吸入性炭疽,与单独使用抗菌药相比,动物表现出更高的存活率[25].Anthim的最佳治疗剂量是16 mg/kg,该剂量用于人体时的AUC大于动物体内的2倍[26],在兔子体内试验时存活率达93%[27],还可有效减少不良反应的发生.需要注意的是,鉴于Anthim易引起过敏反应,只推荐在获益大于风险的情况下使用,且患者必须提前给药苯海拉明,并将Anthim用氯化钠稀释.

3 小结与展望

“动物法则”旨在许可那些能够减少或防止暴露于生物、化学、放射性或核物质造成的严重的或威胁生命的疾病的药物和生物制品获得上市.本综述主要关注的还是针对严重的或威胁生命的传染性疾病的治疗用药品和生物制品以及预防用药品和生物制品的研究,在获批产品举例中,Bio Thrax是“动物法则”概念提出以前即已使用的老疫苗,其余4个新获批产品都是治疗用的单克隆或抗毒素产品,没有新疫苗类.每一种类疾病,每一种类产品,并且具体到每一个产品,所考虑的问题、选择的方法必定有很大差异,必须进行单独的实验设计才能使其数据符合该类疾病、该项产品的实际.

应对可能发生的生物恐怖袭击,既要优化药物和生物制品本身,又要改善外界条件.首先,应该缩短产品的接种程序并扩大产品的适应症,这也是今后新产品发展的主要方向.当然,加强免疫的重要性也不容小觑.某项接种Bio Thrax的实验结果表明[28],只接受初次免疫的受试者体内检测到抗PA IgG的概率为30%,而在接受2或3剂次强化免疫的受试者体内检测到抗PA IgG的概率高达99%.其次,要有足够的疫苗储备.2009年,FDA批准将Bio Thrax的有效期延长3～4年,这有利于美国按照国家战略储备计划进行药品储备,为炭疽恐怖袭击和疫情暴发提供紧急支援.2016年8月,FDA批准Emergent BioSolutions公司一个新的制造工厂用于大规模生产Bio Thrax,该设施将有助于提高Bio Thrax的产量以应对未来的需求.此外,动物模型方面,诸如发烧和气短等人类的某些疾病表现可能难以通过临床观察在动物中识别,未来的研究中开发者可能需要使用遥感勘测技术等更精细的技术来评估受影响的动物.“动物法则”的制定,为人类防治一些棘手的疾病带来了福音,也拓宽了动物实验研究的应用范围.

当然,“动物法则”不是药物审批的捷径,只有更加严格地执行FDA的要求,才能让“绿色通道”真正造福人类.不论是在开发前还是开发过程中,开发者都应该尽早且频繁地与FDA进行交流互动,讨论开发过程中的细节并随时解决出现的问题,避免走弯路.