流感疫苗的研究进展

严延生

1 简 介

2017－2018年全球冬春季流感流行较往年严重,流感疫苗的生产、研究、保护范围及作用效果又引起人们的关注,为此,本文就有关该苗的内容进行了综述.

流感病毒属于正粘病毒科,分为A、B、C和D四个类别,病毒粒子直径约为80～120 nm,为单股负链分节段的RNA病毒.A和B有8个节段,C和D则只有7个节段[1].A和B型流感病毒在多种鸟类中传播并感染包括人类在内的几种哺乳动物;C型流感病毒感染人、猪,D型流感病毒主要感染牛,目前尚不知可否引起人的感染[2].A和B型流感病毒主要引起人季节性流感,对免疫低下的人有危险,每年全球约产生300～500万严重流感病例,导致250 000至500 000人死亡,而大流行则可夺走更多人的生命.WHO建议包括孕妇、6个月至5岁儿童、65岁及以上的老人、具有慢病征候者和医务工作者主要5类人需接种流感疫苗[3].

血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是流感病毒颗粒表面两种主要的糖蛋白,HA与NA分子之比约为4∶1至5∶1,前者主要是促进病毒侵入机体,即病毒通过HA蛋白与宿主细胞融合后,造成感染和疾病的发生;后者则主要功能在于抑制病毒的释放.在鸟类和哺乳动物中,目前共有18个HA和11个NA亚型.按HA抗原差异,可将甲型流感病毒分为两大遗传发育组:第1组(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和 H18)和第2组(H3、H4、H7、H10、H14及 H15亚型)[4-5].几乎所有HA和NA的组合都可在禽类中发现,但在人类中则较为局限,主要包括 H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10;除了这些甲型流感病毒外,还有两种B型流感病毒山形(Yamagata)和维多利亚型(Vectoria)也感染人;引起季节性流感流行的A型病毒主要是H1N1和H3N2亚型,常用的季节性流感疫苗一般是三价苗,B型的两种流感病毒中的一种占其中的一价.如果是四价苗,也就是两种B型流感疫苗占其中的两价.人散发感染禽流感病毒则多见于 H2、H5、H6、H7、H9和 H10亚型,但至目前为止,还未造成跨种属的大规模人感染流行[6].流感病毒变异很快,由于RNA聚合酶在选择压力下不断发生突变,产生“抗原漂移”这一现象;此外在北半球使用的疫苗和南半球使用的疫苗又有所区别,所以在每个流感季节后都需要更新疫苗株,这就需要WHO统一指导全球的流感监测并在此基础上提出抗下个季节流行病毒疫苗株的组成以供生产[7].目前,全球每年能够生产数亿剂次的疫苗,但大多数流感疫苗是用鸡胚制成的[8].

2 流感疫苗的种类和生产方式

目前,通过各国食药监部门批准可市售使用的流感疫苗主要有:鸡胚苗、MDCK细胞苗、杆状病毒表达系统表达的HA蛋白苗和MF59乳剂苗等主要4种类别.

2.1 鸡胚流感疫苗 除少数其他类别的疫苗外,流感疫苗主要用受精卵发育的鸡胚来生产,其优点在于:①目前已有足够的生产鸡胚流感疫苗的设施,每年可以生产15亿剂次,可满足全球人口每年对新季节性疫苗的需求,而其他疫苗生产技术则难以适应全球的需求[9];②由于技术方法稳定并可大量生产,因此鸡胚生产的流感疫苗是目前价格最为便宜的疫苗[10],低成本并基本可预防流感,这一点对发达国家和发展中国家都适宜.目前已发展的、在组成上有病毒颗粒的甲醛灭活苗、裂解苗和亚单位苗.灭活苗保持了完整的病毒颗粒,其预防免疫效果也最为突出;裂解苗系由完整的病毒颗粒经裂解后,暴露出各病毒组成成分;亚单位苗,主要是血凝素HA成分,免疫效果类似裂解苗,副作用较之灭活苗更小,只在儿童和65岁以上老人的人群中使用.

生产合格的鸡胚苗最大的难题是对疫苗株的筛选确定.首先将选定的A型野生株与PR8(鸡胚高适应株,A/Puerto Rico/8/1934[11])在同一个鸡胚中生长重组,重组株含有野生株的HA及NA的两个基因片段及PR8的其余6个片段;其次重组株在鸡胚中做适应性生长;第三用WHO在雪貂中制备的抗体筛选能产生高抗原滴度的 “候选疫苗病毒”(CVVs)株,筛选确定出CVVs.WHO指导全球流感监测并负责每年召集两次会议(北半球在3月份,南半球在9月份),此后将CVV交付给有资质的厂家进行生产[12-13].

虽然鸡胚生产的流感疫苗的工艺十分规范,但A型重组病毒株在鸡胚中的适应仍然存在问题,尤其是H3N2病毒,在鸡胚中常生长不好并费时[14],这就可能导致对疫苗株的筛选预测不准确的难题发生.如在2003－2004流行季节里,当时预测A/福建/411/2002株样病毒可能将在2003－2004流行,但该株起先无法在鸡胚中培养而用前一年的H3N2菌株[15]来代替,但这种替代并未能解决预测的A/福建/411/2002株样病毒可能流行的问题,致使当年超过82%病例则是由A/福建/411/2002株样病毒感染产生[16].

研究表明,重组病毒在鸡胚中生长的适应性与禽类受体有关.人体上呼吸道细胞HA受体的主要成分是α-2,6连结的唾液酸,而禽类病毒的受体多是α-2,3连结的唾液酸,这可能是受体结合不良导致人流感病毒H3N2病毒在鸡胚中生长不好的的主要原因[17-18].为了适应生长,HA蛋白首先要适应鸡胚中的受体.而HA蛋白的结合区域位于球形头部区,其中包含以中和抗体为靶标的主要抗原位点,为了适应生长,就可能发生HA抗原性改变,而CVV的生成通常要通过不断地检测分离株的抗原性,由于个体中流感免疫反应的复杂性与多次暴露于不同毒株有关,因此很难准确预测特定疫苗株的抗原性是针对哪一个毒株的[19],这样选择的疫苗就不能很好地和正要流行的病毒匹配[20].最近几年里,疫苗效果不佳,推测与这种原因不无关系[21].在2017－2018年度流感流行季里,研究证实了这个推断,H3N2流感疫苗在适应过程中发生了一个氨基酸突变,导致了疫苗HA蛋白的糖基化,这使得在美国流行的H3N2流感中,疫苗只起到25%的效果[20-22].就是经过从筛选到生产这么复杂的过程,鸡胚苗的保护率最多也仅有60%[23].2.2 狗肾细胞株(MDCK)流感疫苗 2012年,美国FDA宣布批准了首个非鸡胚生产的流感疫苗Fluelvax○R[24],Fluelvax○R是一个基于细胞(即 MDCK)的流感疫苗生产平台,由诺华公司的流感疫苗团队开发(现由Seqirus公司生产).当然还有其他的哺乳动物细胞如人胚视网膜细胞(PER.C6),猴肾细胞(Vero),人胚肾细胞(HEK293)也陆续进入临场试验.Fluelvax○R生产使用,给流感疫苗生产注入了新鲜血液,它有以下4大优点值得肯定:一是利用细胞,减少了鸡胚短缺的潜在限制(鸡胚苗生产依赖于大量的鸡胚供应,有时会因为供应的原因而使生产时间变慢),使用细胞生产就不会出现鸡胚供应不上的问题,疫苗病毒的生产只取决于生物反应器的容量[25-26];二是HA蛋白的糖基化对免疫原性有积极作用;使用鸡胚与哺乳动物细胞,生产出的流感疫苗表现出截然不同的糖基化谱,相对而言,MDCK疫苗能更好匹配于流行毒株;第三,由于用的是细胞而不是鸡胚生产,所以不存在对鸡胚疫苗过敏的风险;第四,也许是最值得注意的是,哺乳动物细胞生产疫苗减少了HA的突变.最初,Flucelvax○R也是用鸡胚筛选确定CVV,这意味着在鸡胚中适应的前期问题仍有存在[14].但在2016年,美国FDA规定所有的Fluelvax○R必需完全使用基于细胞的CVV,以确保其不受鸡胚适应性的影响.研究表明,这样的规定使得在2017－2018年流感流行季节里,“以细胞为基础的疫苗相对于以鸡胚为基础的疫苗,其疫苗的保护效果提高了约20%”[22].

虽然细胞平台有许多优点,但仍有不足之处,主要在于全球细胞生产流感疫苗的设施目前还没有到位.据美国Seqirus公司称,在2017－2018年度流感季节里,该公司大约只能向美国提供“2150万剂次”的Flucelvax○R疫苗(包括其中含有18%的四价疫苗)[27].其次,由于细胞的生产不足,价格也比鸡胚疫苗高出40%.很明显,细胞系统目前还无法取代整个以鸡胚为基础的低成本疫苗生产.

2.3 杆状病毒系统表达的流感疫苗 另一种可避免鸡胚苗的问题系最近蛋白科学公司(Protein Science Corporation)研制的FluBlok○R疫苗[28].在基于MDCK细胞疫苗问世后一年,美国FDA批准了FluBlok○R.不同于鸡胚和细胞疫苗生产,FluBlok○R利用杆状病毒表达系统表达HA蛋白.首先利用RT-PCR或用人工序列合成的方式制备HA模板,将流行株的HA基因克隆到杆状病毒载体中,此后将重组杆状病毒转染昆虫细胞,产生纯化的重组HA蛋白用于疫苗的生产.这种策略不再需要拯救流感病毒来选择高产重组株,因此,该技术不仅生产快,还因为其不受鸡胚适应问题的影响,能产生与流行病毒HA精确匹配的结果,可使流感疫苗的生产随之流感病毒流行的变化而变化[29-30].但这种策略也存在不足之处,即FluBlok○R的价格是鸡胚疫苗的2倍,这使许多病人选择较为廉价的鸡胚或其他细胞疫苗[31];其次由于季节性流感变异,FluBlok○R还存在所谓保质期的问题,其储存时间不能超过9个月[32].由于生产设施不足,甚至无法满足美国一个流行季所需的FluBlok○R疫苗剂量,且其成本较高及保质期较短,因此FluBlok○R还不能完全取代鸡胚疫苗的生产.

2.4 特殊乳剂疫苗 美国FDA近期批准的另一种替代传统的鸡胚疫苗生产方法是很简单的,也就是在传统的鸡胚疫苗中加入佐剂来增加疫苗抗原免疫应答的强度.这种疫苗称为FLUAD,于2015年在美国被批准供65岁及以上人群使用,并于2016－2017流感季开始启动使用[33].FLUAD疫苗自1990年代末以来已批准在其他国家使用,剂量超过8 500万剂.该疫苗虽仍为鸡胚生产,但它因使用MF59乳剂而有别于其他鸡胚苗[34].这种乳剂主要成分为角鲨烯,是一种在人体内常用的合成胆固醇和其他类固醇的有机化合物.MF59通过诱导免疫细胞到注射部位增强免疫应答,主要在于增强对抗原的摄取和随后的免疫反应.虽然这种疫苗目前只用于65岁以上的患者,但最近的研究已证明该疫苗在儿童中也可诱发强有力的免疫反应[35],同时研究也表明MF59的加入可以诱导非疫苗株的交叉反应.使用MF59的鸡胚疫苗比不使用的免疫应答要强,也易于增加其在鸡胚生长中的适应性.广泛使用MF59唯一的问题最常见的是在注射部位可发生疼痛这样轻微的副作用,这可能由于接种时免疫细胞聚集于注射部位的结果[33].

3 现正研制中的下一代季节性流感疫苗

3.1 双HA基因鸡胚苗 美国FDA目前所批准的流感疫苗常为非鸡胚生产的流感疫苗,但与标准的鸡胚疫苗相比,这些疫苗的使用仍然相对有限,主要原因与生产设施的受限有关.因此,改善季节性流感疫苗传统的鸡胚研制和生产仍有必要.但目前一些研究团队只是简单地避免以鸡胚为基础的疫苗研制,为了克服传统流感疫苗的局限性,Harding等最近报告了以改进筛选预测CVVs为主的基因重组法,该重组疫苗可在鸡胚中生长,但避免了发生鸡胚适应性突变[36].其主要方法在于构建一个同时含有可表达HA和NA蛋白的重组株,其次在另一片段(原为NA表达片段)中表达第二个HA.这个方案可以使我们在同一个重组株上既表达一个适合鸡胚生长的辅助HA又表达一个与流行有关的HA,这就消除了H3N2病毒最初在鸡胚中难以生长而造成变异的因素[37-39].用这种双HA系统,研究认为其不造成HA的单适应性突变,辅助HA使重组株可以很快适应在鸡胚中的生长,而克隆入与流行有关的HA产生的中和抗体可抗临床流行株,起到很好的CVV筛选作用.与其他替代策略相比,本法可以充分地利用全球已有的鸡胚疫苗生产设施[36]来生产流感疫苗.虽然这种方法仍然容易受到鸡胚短缺的影响,也不适合有严重鸡蛋过敏史的人,但该系统可按目前相同的标准和价格大规模生产疫苗,仍然是不失为一种很好的替代办法.

3.2 纳米粒子苗 目前正在开发的另一种替代疫苗是使用纳米粒子.Novavax公司研制的纳米流感疫苗平台NanoFlu不久将进入第一期临床研究阶段.该平台类似于杆状病毒系统,但以粒子为基础,使用在细胞株中表达HA抗原[40-41];与鸡胚疫苗生产不同,细胞表达的HA被纯化并组装在纳米粒子中,与难以适应鸡胚疫苗并可能造成变异不同的是纳米粒子中的HA保留了与杆状病毒表达HA的同样优点.但与FluBlok不同的是,在纳米溶液中纳米粒子只是作为HA蛋白的载体,研究证明这种颗粒形式的抗原通常能够起到自我佐剂的作用而增强免疫反应[42-43].此外,基于纳米粒子的策略有些类似于通用疫苗,能够激发广谱且普遍的抗流感免疫反应[40-41].纳米粒子疫苗可产生广泛的反应性抗病毒抗体,使得特定的纳米粒子疫苗与标准的季节性流感疫苗相比,其保护的时间更长,大大提高了季节性疫苗的效果.但目前缺乏纳米疫苗生产设施,就像其他非鸡胚疫苗一样,这种研制法无法满足一个流行季节所需的剂量;此外,目前还无以纳米粒子为基础的疫苗的审批先例,这也是纳米苗研制生产的重大问题.

3.3 肽苗 基于肽的疫苗是另一个疫苗研制方法.该平台依赖于合成B和T细胞识别特定表位的流感蛋白(一般是HA,M1/M2和NP蛋白).合成后,把纯化肽装载到脂质体或病毒体中,这两者自身既可作为佐剂又可作为递送抗原的载体,但研究认为脂质体或病毒体可能更适合用于疫苗抗原的传递运送[44-45].脂质体和病毒体组成的疫苗已经进行了临床前试验,并证明可引发抗流感病毒感染的保护作用.肽疫苗可经人工合成,它既无鸡胚供应问题及也无与鸡蛋有关的过敏问题,在对特定抗原的免疫应答方面其类似于纳米颗粒疫苗,显示了潜在的更为普遍的保护作用[46].由于肽疫苗的配方非常复杂,它包括了抗原性肽、脂质体/病毒体等成份在内[44],因此优化这些组成需费时,其成本目前也无法核算,此外用于生产这些疫苗的设施目前更是很有限.

3.4 核酸苗 另一种很有发展前景的方法是核酸疫苗.不像前面提到的任何策略,核酸疫苗不依赖于蛋白质的生产,与之相反,它只需要重组DNA或RNA分子.一般来说,核酸疫苗需携带表达HA的核酸,HA的核酸序列被克隆到表达质粒中,在如大肠杆菌之类的细菌细胞中大量转录复制后,按所需被制备成RNA或DNA疫苗.通常用注射接种方式,将核酸苗注入体内,宿主细胞吸收RNA或DNA,表达所需HA抗原.已经成功地进行了核酸苗的一期的临床试验[47-48].虽然DNA疫苗和RNA疫苗在研制上有一些的区别,但其共同的优势是这样研制的疫苗不受毒株在鸡胚中适应的影响,其所表达的抗原也能与流行株相同;此外核酸苗不像蛋白质苗那样,容易大量快速的生产,而且传递也特别简单.虽然核酸苗的优点较多,但其挑战也很大.在兽医方面,该苗有被审批使用的先例[49],但在人医方面还未有.此外,核酸导入细胞可以激活许多天然免疫信号通路[50],这将干扰降低疫苗的效力.

4 通用疫苗

前已述及,流感病毒的HA有18个亚型、11个NA亚型,目前在人类及动物中起码已发现了几十种流感病毒.流感病毒在人类经常发生抗原漂移而产生新的流感病毒,在全球也还存在着南北两半球抗原特点不同的流感病毒,因此选择一种通用的流感苗就成为人们的期望.

通用疫苗其被期望能达到的功能即是在疫苗接种后能在体内产生广谱中和抗体.首先确定的是中和抗体与HA的茎部表位有关,其后又发现HA蛋白头部也产生强烈的结合抗体,HA亚型的构成与HA蛋白头部的抗原及受体不同有关,而HA的茎部区则很保守.此外,少数嵌合在包膜上M2e区也可产生广谱中和抗体,而且M2e蛋白也是高度保守的,这就奠定了通用苗的研制基础主要是HA的茎部区和第7片断产生的M2e蛋白区这两个抗原的保守区域[51-52].其次,如何递送这些保守结构域,使这些保守结构域经过特殊的抗原提呈能够在机体引起强烈的免疫反应,用融合蛋白、病毒样颗粒和非致病性病毒等都试过对这些结构域的传递.第三,临床研究发现早期感染流感而发生强烈T细胞免疫反应的人有更好地抗感染结果,而T细胞对保守结构域的表位也有反应,但反应并不强,研究显示因为保守表位基本上都位于内部蛋白质结构域上,而这些内部蛋白质结构域免疫原性不强,尤以M2e蛋白最弱,所以通用疫苗的研究目前主要以HA的茎部区为免疫原;第四,目前研究则主要集中使用佐剂来提高通用疫苗产生抗感染所需的足够强大和持久的免疫反应的能力[52-53].

5 小结和展望

流感疫苗研制,源于上世纪30年代,迄今已有70多年的历史.最初的流感疫苗系用流行株单苗灭活苗接种,效果当然不好.60年代,美军方用多亚型灭活苗混合,效果趋于改善,直至70年代,开始采用重组适应方法筛选CVV,疫苗保护率有明显的提升,在WHO的指导下,全球范围内基本上都采用鸡胚疫苗的生产技术.发展至今,虽然有小部分细胞苗代替,但仍不足以供应全球使用.基于这个原因,目前还主要以生产鸡胚苗为主,但因适应株的原因须要在这方面不断改善.

在我国,流感疫苗属于二类苗,即是自费使用的疫苗.除敏感人群外,免疫系统完全及强壮者则不需考虑使用.因此各国除了对65岁及以上的老年人、慢病征候者及医务工作者有统一要求外,对于儿童年龄、疫苗组成及免疫程序均有不同,如在一些国家就认为裂解苗与亚单位苗免疫原性较差,需要对此类疫苗进行基础及加强免疫的要求[54],而欧盟几年前就没有要求使用[55].另外冷适应减毒疫苗可能在免疫低下人群发生重组而产生新流感病毒,在我国和其他一些国家,就不考虑引进或研制,而在另一些国家,则只限定在2～7岁儿童中使用[56].

自1918年发生H1N1西班牙流感大流行以来,迄今为止全球范围起码已发生了4次流感大流行,随着人类对流感大流行威胁的关注以及科学技术的不断发展,很难想象再发生类似1918年惨绝人寰的“西班牙”流感大流行,这从2009年源自墨西哥的“猪流感”大流行可以得到回答,起码在我国,2009年H1N1大流行疫苗的研制还是使用鸡胚苗.但从下一代发展的疫苗并权衡生产设施来看,双HA基因鸡胚苗应是较为适宜,期望其尽快完成研究与审批工作.

通用疫苗是人们期盼20多年的产物,但如何提高该苗对各变异株的广谱中和能力确实是一个大问题;从目前研究结果来看,它还不能进入实用.本文认为M2e抗原性很弱,难以引起强的免疫应答;使用佐剂也难以达到其通用抗感染的能力.只有HA2颈部区的保守抗原表位还有希望,但近年内难以有HA2颈部区通用疫苗的产生[57-58].因为有这些问题的存在,因此我们只能是关注通用疫苗的研究发展,而不是等待使用.