上皮细胞microRNAs防御微小隐孢子虫感染的先天性免疫调节作用

张贵玲,王艳歌,张素梅,张龙现,王荣军

隐孢子虫(Cryptosporidium)是1907年由Tyzzer在实验小鼠胃内首次被发现,目前隐孢子虫属内已鉴定出34个有效虫种及60多个基因型[1-2].隐孢子虫感染包括人类在内的多种脊椎动物宿主的胃肠道上皮细胞,在免疫功能正常的个体中主要引起急性、自限性腹泻,而在免疫功能不全的个体中常导致较高的发病率和死亡率[3-4].C.parvum是最重要的人兽共患虫种,在全世界最近报道的325起寄生性原虫病的水传暴发病例中,C.parvum占50.8%(165/325)[5].

miRNAs是一类约22个核苷酸的内源性非编码RNAs,在细胞分化、增殖、凋亡等多种生物过程中发挥重要的调节作用[6].C.parvum感染上皮细胞后通过改变宿主基因的表达谱维持寄生虫与宿主保护机制之间的微妙平衡[7].Zhou等分析了C.parvum感染胆管上皮细胞后成熟miRNAs表达谱,鉴定出4个miRNAs显著上调,19个miRNAs显著下调;Real-time RCR检测显示5个miRNAs(miR-125b、miR-21、miR-23b、miR-30b、miR-16)在感染后12～24 h表达增加,而在感染后2～8 h无变化[8].数据分析显示,miR-125b-1、miR-21、miR-23b-27b-24-1和miR-30b通过启动子连接于NF-κB亚单位P65的方式被转录激活;筛选P65依赖的miRNA功能抑制后增加C.parvum感染负荷.miRNA作为细胞应对环境应答的微调机制,参与宿主细胞防御微生物感染的免疫反应.C.parvum感染上皮细胞也为探索miRNA介导的防御机制提供理想模型.本文主要概述了参与防御C.parvum感染的宿主miRNAs以及调控机制.

1 Let-7i

Let-7基因最初作为秀丽隐杆线虫的关键发育基因被发现[9].研究显示,let-7家族的miRNA由编码9个不同的成熟let-7 miRNAs的let-7a至let-7i的12个基因组成,在细胞增殖、分化中发挥重要的作用[10].Let-7家族 miRNAs与SNAP23 3′UTR之间存在保守的互补性,C.parvum感染上皮细胞后,激活TLR4信号通路,减少let-7表达,解除let-7 miRNAs对SNAP23的翻译抑制,增加SNAP23表达,释放导管素-37、β-防御素2等外质体,抑制C.parvum活性[11].

Let-7i作为miRNA let-7家族的成员之一,诱导沉默信息调节因子1(SIRT1)表达,调节TLR4/NF-κB信号通路介导的上皮细胞防御C.parvum感染的炎症反应[12].Chen等报道,C.parvum感染人类胆管上皮细胞可通过激活My D88/NF-κB信号通路减少let-7i表达,解除let-7i介导的SIRT1翻译抑制,SIRT1过表达促使NF-κB的Rel A/P65亚基发生去乙酰化作用,抑制NF-κB激活,负反馈调节TLR4/NF-κB信号通路,消除NF-κB介导的炎症反应[13-15].体外实验证明,let-7i与TLR4 m RNA 3′UTR区域结合以翻译抑制方式降低C.parvum诱导的TLR4的水平[16].NF-κB P50和C/EBPβ属于b-Zip转录因子家族,C.parvum感染上皮细胞后,NF-κB p50和C/EBPβ形成沉默复合体,结合到let-7i启动子上,启动组蛋白-H3脱乙酰作用并抑制let-7i转录,解除let-7i介导的TLR4的翻译抑制,进一步激活NF-κB信号通路,促进防御C.parvum感染的固有免疫应答[17].

2 miR-98

C.parvum感染上皮细胞的体外实验证明,miR-98靶向SOCS4的3′UTR区域,通过转录后水平抑制SOCS4表达.CIS和SOCS蛋白是细胞内的分子家族,在许多细胞类型中主要作为细胞因子应答的生理学调节蛋白发挥作用[18].每个CIS/SOCS蛋白都有一个SH2域和一个SOCS盒,SH2域与底物上磷酸化的酪氨酸残基结合,同时,CIS/SOCS蛋白的E3活性可引起底物的泛素化以进行蛋白酶体降解[19].CIS/SOCS蛋白起着E3泛素化连接酶的功能,与JAK/STAT信号级联相互作用介导被激活的细胞因子信号复合体的降解,引起负反馈调节.

Zhou等报道,C.parvum感染上皮细胞后,通过TLR4/My D88信号通路减少miR-98表达,解除miR-98介导的CIS/SOCS4的翻译抑制,CIS/SOCS4表达增加,抑制C.parvum诱导的STAT3和STAT6的磷酸化,最终促进上皮细胞防御C.parvum感染[20].

3 miR-27b

miR-27b是一种内源性调节RNA,C.parvum感染上皮细胞后,激活宿主细胞TLR4/NF-κB信号通路,增加miR-27b表达.miR-27b通过靶向KSRP 3′UTR区域,引起翻译抑制,减少KSRP表达.KSRP是一种RNA结合蛋白,与3′UTR内具有AREs的m RNA相互作用.iNOS m RNA的3′UTR区域含有ARE序列,KSRP与iNOS m RNA的3′UTR区域AREs结合,调节iNOS m RNA的稳定性从而调节iNOS表达[21].研究显示,KSRP shRNA可消除miR-27b前体对iNOS m RNA稳定性的影响.通过体外和动物模型研究表明,上皮细胞中NO产物主要由iNOS调节,NO可通过直接杀死或限制寄生虫生长的方式促进宿主防御微生物感染的固有免疫应答[22].因此,当C.parvum感染上皮细胞后,通过NF-κB途径增加miR-27b表达,减少KSRP表达,增加iNOS m RNA稳定性,iNOS促进NO生成,最终通过固有性免疫应答抵抗C.parvum感染[23].

4 miR-513

研究表明,胆管上皮细胞通过表达几个B7协同刺激分子应答炎症刺激[24].B7-H1作为B7协同刺激分子B7家族关键的成员,参与调节细胞介导的免疫应答[25-26].在人类胆管上皮细胞中,miR-513靶向B7-H1的3′UTR区域,介导蛋白质的翻译抑制[27].体外研究表明,C.parvum感染上皮细胞后,miR-513表达减少,解除B7-H1的3′UTR区域结合位点的翻译抑制,增加B7-H1表达,B7-H1可连接活化的T细胞诱导凋亡细胞死亡,最终引起防御C.parvum感染的炎症反应[28].

5 miR-221

m RNA的3′UTR区域能特异性的控制个体mRNA的翻译率和降解率,也可作为miRNA靶标[29].在人类胆管上皮细胞中,miR-221靶向细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的3′UTR区域,诱导内源性翻译抑制.ICAM-1是由包括内皮细胞和上皮细胞在内的几种细胞类型表达的Ig超家族的90 k D成员,可稳定细胞间的相互作用.微生物感染后,促炎症分子IFN-γ通过STAT-1机制抑制miR-221表达,解除miR-221对ICAM-1 3′UTR的翻译抑制,促进ICAM-1表达[30].C.parvum感染人类胆管上皮细胞后,抑制miR-221表达,ICAM-1表达增加,促进上皮细胞黏附分子释放,帮助上皮细胞识别淋巴细胞等免疫细胞,激活适应性免疫反应[31].

6 miR-424/miR-503

组蛋白乙酰转移酶和脱乙酰酶(HDACs)主要由HDAC1、HDAC2和HDAC类型3(Sirt1)组成,组蛋白乙酰化是控制染色质结构、DNA可及性和基因表达的关键表观遗传机制,可引起染色质结构解开,允许转录因子进入启动子位点[32-33].当HDAC促进脱乙酰化时,HDAC功能的抑制增加组蛋白的乙酰化作用并激活基因转录,同时,HDAC抑制剂可抑制NF-κB信号通路诱导的细胞因子分泌.趋化因子CX3CL1是CX3C家族独特的成员,它仅与其受体CX3CR1结合并且是其独特的配体,CX3CL1以膜结合形式表达,以可溶性趋化形式脱落,它作为黏附分子与表达CX3CR1的免疫细胞相互作用,包括CD4＋、CD8＋、T细胞、NK细胞和单核细胞[34-36].miR-424和miR-503靶向CX3CL1相同3′UTR区域,启动CX3CL1 m RNA的降解.Zhou等报道,C.parvum感染人类胆管上皮细胞后,诱导miR-424和miR-503基因启动子的NF-κB结合区域相关的p50-C/EBPβ-Sirt-1/HDAC复合物形成,抑制miR-424和miR-503基因表达,解除CX3CL1 mRNA的降解.通过小鼠胆囊注射C.parvum卵囊证明CX3CL1增加CX3CR1＋向胆道粘膜周围渗透,最终通过HDACs和NF-κB信号通路促进上皮细胞粘膜免疫从而防御C.parvum感染[37].

7 小 结

综上所述,宿主miRNAs通过多种途径调节上皮细胞防御C.parvum感染免疫反应的诸多阶段,诸如let-7i和miR-27b通过TLR4/NF-κB信号通路调节宿主上皮细胞的免疫反应,miR-98通过JAK/STAT信号通路调控宿主细胞抗C.parvum的免疫反应,miR-513和miR-221分别通过调控上皮细胞与T细胞、淋巴细胞等免疫细胞的相互作用,调节宿主细胞防御C.parvum的炎症反应,miR-424和miR-503通过HDACs和NF-κB信号调节宿主细胞抗C.parvum感染.目前,C.parvum可以通过调控感染细胞中miRNAs的表达,形成有效的免疫逃避机制,从而抵御宿主细胞的防御[38];而对于宿主miRNAs在防御C.parvum感染免疫方面还有许多难题待研究,比如,宿主原代上皮细胞的分离与C.parvum体外感染细胞模型的建立、C.parvum体内感染动物模型的建立、体内外上皮细胞miRNAs在防御C.parvum感染免疫调控中的功能及其分子机制研究等.因此,深入了解调控上皮细胞防御C.parvum感染的复杂分子网络中的miRNAs的功能,不仅促进对C.parvum发病机制的认识,也为鉴定黏膜表面感染干预性治疗的新靶点提供依据.