针刺内关穴预处理改善心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展

母晓艺，宋艳华 ，张 蒂 ，孙佳琳 ，谭奇纹△

(1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

近年来，随着生活水平的提高，缺血性心肌病发病率逐渐上升，危害着人类的健康。临床心肺复苏、溶栓治疗、心脏外科体外循环、心脏移植等方法的应用使缺血的心肌组织能够得到及时的再灌注，但有时再灌注反而会进一步加重组织损伤，导致组织和器官的功能障碍，称为缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注后氧自由基生成增多，细胞内Ca2+超载，并引发炎症反应，这些因素都会直接或间接造成心肌细胞损害。大量临床及动物实验研究证实内关穴具有特异性治疗心系疾病的特征，针刺内关穴预处理可以改善机体内环境，减轻病理损害。本研究对针刺内关穴预处理治疗心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)的机制研究进行相关文献的综述。

1 减少自由基

心肌缺血再灌注发生时，由于缺氧、应激、细胞损害等原因自由基生成过多，超出机体抗氧化防御系统的代偿能力，细胞的各种成分如膜磷脂、蛋白质、核酸等可与自由基发生反应，破坏细胞结构从而影响细胞正常生理功能。在早期，自由基与细胞膜中不饱和脂肪酸发生过氧化反应，引起膜脂质微环境的紊乱，其产物丙二醇(Malonaldehyde, MDA)可增加细胞膜通透性，引发Ca2+内流，加重细胞损害。Zhang等[1]发现针刺内关穴预处理可以有效激活氧自由基清除系统，增加过氧化物分解酶——谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的含量，减轻心肌细胞膜脂质过氧化反应，减少过氧化产物MDA，起到保护心肌细胞的作用。Nrf2-ARE信号通路是激活抗氧化酶的关键通路。自由基含量增多时,氧化剂刺激Nrf2蛋白从胞浆稳定体中解离，进入细胞核。其与ARE结合激活通路并作用于下游相关抗氧化酶基因，从而增强机体抗氧化能力。邵明璐等[2]发现内关穴预处理后血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性升高，Nrf2及HO-1基因表达上调，心肌细胞损害减轻；针刺内关穴可上调Nrf2-ARE信号通路，从而带动下游抗氧化酶的表达以提升氧自由基清除能力，起到保护心肌的作用。

2 减轻炎症损害

炎症反应在心肌缺血再灌注过程中扮演了重要的角色。缺血再灌注发生期间，白细胞(主要是中性粒细胞)明显增加，其浸润数目越多，对心肌组织造成的损害越严重[3]。激活的中性粒细胞可释放大量的致炎物质，造成自身及血管内皮细胞的损伤。针刺内关穴可通过多种细胞信号途径，抑制趋化因子和黏附因子的释放，减少白细胞聚集，同时调节血管活性物质的释放，保护微血管，具体作用如下。

2.1 减少白细胞聚集

缺血再灌注期间，细胞黏附分子和炎性因子如血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等生成增多[4]，诱导白细胞粘附于血管内皮，白细胞与血管内皮细胞之间相互作用，造成细胞损害和微循环障碍。胡惠林等[5]发现针刺内关穴预处理可以明显降低炎症相关蛋白TNF-α、VCAM-1、核转录因子NF-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达，控制炎症反应。邵忠华等[6]研究发现电针内关穴可以通过降低高迁移率族蛋白1( high mobility group box 1,HMGB1)的表达，减轻心肌组织内炎性细胞的浸润。HMGB1是一种重要的“晚期”炎性细胞因子，不仅能促使TNF-α、IL-1等促炎因子的表达，还能激活MAPK信号通路促使核转录因子NF-κB发生核移位[7]，NF-κB的激活能够活化炎性细胞因子[8]，因此抑制HMGB1蛋白的表达能够减轻炎症反应。同时，钱钢等[9]的实验进一步证实针刺内关穴对HMGB1蛋白的抑制作用与JAK/STAT通路的激活密切相关。

2.2 保护微血管

再灌注期间缩血管物质大量释放，舒张血管的物质合成受到抑制，引起微血管循环障碍并可能引发无复流现象。王双昆等[10]的动物实验证实，大鼠发生心肌缺血再灌注损伤后，具有强大的收缩血管及诱导血小板聚集作用的血浆内皮素(ET)、血栓素(TXB2)含量升高；具有舒张血管及抗血小板聚集作用的6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)相对减少。针刺内关可调节以上的血管活性物质，改善微血管舒缩，增加心肌血氧供应。同时实验还发现不同频率电针对血管活性物质的调节作用不完全相同；NO具有舒张血管的功能，采用高频电针预处理内关穴，相较低频电针，血清NO升高更为明显，而ET、TXB2及6-keto-PGF1α的变化无明显差异。降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)具有强大的血管扩张作用[11]，再灌注时其过量的释放会引起血管的过度扩张，加重心肌的再灌注损伤。林亚平等[12]发现，电针内关穴预处理可有效降低再灌注后血浆内CGRP的含量，使其维持在一个相对较高的浓度，发挥舒张血管的有利作用，且高频电针作用下CGRP下降更为明显，其维持的浓度更有利于心肌细胞的保护，减轻MIRI。

3 减轻细胞内钙超载

缺血再灌注时，细胞Na+-Ca2+交换异常，Ca2+内流增加及内质网中Ca2+的释放导致钙超载。钙超载不仅加重细胞结构的损害，还可引起心肌纤维过度收缩，引发再灌注性心律失常。针刺内关穴预处理可有效降低缺血心肌细胞内钙离子浓度，减轻钙超载[13]袁叶等[14]证实针刺内关穴可明显提高血清钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的含量，促进CRT表达的上调，从而抑制肾小管上皮细胞内质网中Ca2+的释放，减轻钙超载[15],保护心肌细胞。田岳凤等[16]进一步从基因角度证实针刺内关穴可提高CRTmRNA的表达率，帮助维持细胞内Ca2+稳定。CaMKⅡ是一种Ca2调节酶，钙超载时其活性增强。CaMKⅡ可作用于肌浆网上的不同受体，控制肌浆网内钙离子的释放与吸收，减轻细胞内钙超载并恢复心肌细胞兴奋收缩耦联[17]。针刺内关穴可调节蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达，减轻钙超载，同时对心肌细胞其到良好的保护作用[18]。

4 抑制细胞凋亡

心肌缺血再灌注期间内环境的改变促进了细胞凋亡的发生，这种病理上的变化会进一步加重MIRI。影响凋亡进程的相关基因中Bcl-2有抑制细胞凋亡的作用，其同源水溶性蛋白Bax是人体重要的凋亡基因，针刺内关穴预处理可提高Bcl-2的表达水平，同时抑制Bax，扩大Bcl-2/Bax的比值以减少凋亡，保护心肌细胞[19]。其作用途径主要是通过切断外源性信号传递、抑制内质网应激、保护线粒体结构等影响介导凋亡的因子。在外源性信号传导过程中Fas蛋白与Fas配体(Fas-L)结合将凋亡信号导入细胞内，引起凋亡蛋白酶、限制性内切核酸酶的活化以裂解细胞蛋白，降解DNA片段并最终导致细胞死亡[20]。林海波等[21]证实针刺内关穴预处理可抑制Fas/Fas-L蛋白的表达，减少细胞凋亡，且具有48 h的延迟相保护效应，可为临床针刺介入时间提供初步实验依据。线粒体是介导细胞凋亡的重要细胞器。缺血再灌注时，由于内环境的改变，线粒体通透性转换孔(MPTP)持续开放、线粒体膜电位降低、磷脂膜结构破坏使促凋亡分子如细胞色素C释放到胞质，经一系列酶促反应激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase,凋亡蛋白)，最终导致细胞凋亡[22]。MPTP在线粒体介导细胞凋亡中扮演着重要的角色，再灌注时期细胞内Ca2+超载、自由基聚集等因素会导致MPTP的开放，冯果等[23]实验研究发现电针预处理内关穴可激活心肌细胞膜上的蛋白激酶C(PKC)，PKC启动ATP敏感性钾通道(KATP)，K+外流增加进而抑制Ca2+内流，在减轻胞内Ca2+超载同时抑制MTPTP的开放，减轻细胞凋亡。针刺内关穴预处理在再灌注时期提高SOD的活性、减轻自由基在心肌组织中的聚集的作用对线粒体有良性的保护作用，实验证实针刺后线粒体水肿减轻，线粒体膜电位上升并趋于稳定，MPTP开放减少，从而减少心肌细胞的凋亡和坏死，对心肌产生保护作用[24,25]。缺血再灌注时细胞中内质网合成、加工蛋白质的功能受到影响，内质网内错误折叠蛋白增多，触发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)[26]以分解错误蛋白，如果内质网内错误蛋白积累过多，超出细胞代偿能力，将引发内质网应激(ERS)。Caspase-12、CHOP蛋白介导的细胞凋亡均与ERS密切相关。翟昌林等[27]发现电针内关预处理可以抑制ERS，减少心肌细胞caspase-12、CHOP蛋白的表达，抑制细胞凋亡。

5 调节细胞自噬

细胞自噬是真核细胞的一种程序性保护机制，在溶酶体酶的作用下降解错误蛋白、受损细胞器并对其成分进行再循环利用以维持细胞内环境稳态，自噬作用过多或过少会导致细胞死亡。Beclin 1基因是调控细胞自噬的关键基因，心肌缺血、缺氧时Beclin 1基因表达无明显变化而再灌注时期其表达显著升高，抑制这种过度表达可降低心肌细胞的死亡率[28]。此外Beclin 1基因与抗凋亡基因bcl-2可互相影响彼此介导的细胞活动，Beclin 1突然升高造成的失衡会加速细胞死亡[29]。谭成富等[30]发现，针刺内关穴预处理可降低Beclin 1的表达，调节再灌注时期的细胞自噬活动，平衡其与凋亡间的反馈作用，达到心肌保护作用。

6 诱导保护性蛋白增加

热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是细胞在接收应激刺激后，诱导产生的一种保护蛋白。再灌注时期，HSP可从稳定细胞内变性蛋白质、干扰应激所启动的细胞调亡程序、减轻细胞离子紊乱等方面稳定细胞内环境，维持细胞功能，避免MIRI的发生[31]。谭成富等[32]观察针刺内关穴预处理对HSP家族中最主要的三类蛋白：HSP90、HSP70、HSP27的影响，发现HSP70在针刺后即刻便出现表达增强，并于针刺后48 h内处于高表达状态；HSP27的变化较晚，在针后24～48 h内表达增强；而HSP90受针刺影响较小，在各时间段其含量无明显变化。HSP含量的变化说明针刺对MIRI的保护效应具有时间差异，并具有延迟相保护作用。

7 维护心肌细胞缝隙连接

缝隙连接(Gap junction,GJ)是细胞间进行直接信息交流的细胞内通道，可迅速将细胞内的信息通过电信号或化学递质传递给相邻细胞。缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)是GJ通道的基本结构和功能蛋白，在心室肌细胞内Cx主要由Cx43构成。周丹等[33]实验发现，缺血再灌注时GJ分布稀疏、扭曲，Cx43表达下降。电针预处理内关穴后GJ结构完整性得到保护，Cx43表达量提升。说明针刺内关穴预处理通过参提升心肌细胞Cx43表达，参与缺血再灌注心肌细胞的保护。Cx43有两种不同的状态，即磷酸化和去磷酸化，Cx43只有在磷酸化状态下才具有功能活性。实验发现心肌缺血会引发Cx去磷酸化且Cx43总量不变[34]，这种磷酸化的改变会减弱细胞间的耦合，引起严重的心律失常[35]。Gao等[36]研究发现电针内关预处理可显著减少去磷酸化的Cx43的含量，从而改善受损的GJ,减少再灌注期间心律失常的发生。

8 调控细胞色素P450代谢通路

花生四烯酸细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)是体内参与多种内源性和外源性化合物代谢的一系列酶系，可代谢花生四烯酸。花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)经CYP450代谢途径可产生环氧二十碳三烯酸(EETs)及20-羟-二十烷四烯酸(20-HETE)。EETs具有强大的心血管效应，具有抗炎、扩血管、溶纤、抗凋亡和促血管生成作用[37-38]而20-HETE在再灌注期间会造成心肌组织蛋白过氧化损伤，加重MIRI[39]。代谢花生四烯酸产生EET的CYP亚家族以CYP2C和CYP2J为主[40]，生成HETEs的主要是CYP4家族，主要是CYP4A和CYP4F。李洋等[41]运用基因芯片技术分析内关穴调节MIRI作用的潜在通路和靶基因。结果表明电针内关穴预处理可上调CYP2家族基因，促进EETs生成同时下调CYP1和CYP4家族基因，抑制内源性20-HETE生成，调节细胞代谢减轻MIRI。

9 讨论

内关善治心胸诸疾，早在《灵枢·经脉》篇中提到：“心系实则心痛，虚则为头强，取之两筋间也。”后世有《百症赋》“建里内关，扫尽胸中之苦闷”和《标幽赋》“胸腹满痛刺内关”的经验总结。中医“治未病”思想倡导“未病先防，既病防变”，内关穴对心肌的保护作用在心肌缺血再灌注损伤的防治中有很大的应用前景，实验证实在心肌组织发生病理改变前针刺内关穴即可减少缺血再灌注对心肌组织的损害，临床中，可以采用这种简单的干预手段，在缺血期及溶栓治疗前针刺内关穴以心肌起到良性保护作用。目前其作用机制研究虽深入到分子生物学水平，但多为研究单一蛋白或基因的表达对细胞信号途径或细胞内环境的影响，尚未形成完整的理论体系，对作用主次及先后还缺乏细致的研究。随着基因芯片技术的应用，能够实现同一时间对数以万计的基因进行大规模平行检测与分析，从而实现对内关穴调节作用进行多系统、多靶点分析，在未来的实验研究中有广泛的应用前景，其作用机制的清晰和完善将为其在重大疾病的应用提供更完善的理论支持和新的治疗思路。