CircRNA与骨相关疾病

翟乃祥 任秀智 鲁艳芹 韩金祥*

1. 山东省医药生物技术研究中心，山东省医学科学院，山东 济南 250062 2. 济南大学-山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南 250200 3. 天津市武清区人民医院，天津 301700

遗传性骨病是临床上表现出具有较强遗传异质性的骨、软骨发育不良的疾病，以骨骼塑形、生长、分化、内部稳态等异常为特征，多为发病率较低的罕见病，遗传性骨病患者是庞大的群体。近年来不断有研究发现circRNAs在疾病调控中的作用，本文就circRNAs对骨相关影响的研究进行总结。

1 CircRNA及其特点

1.1 CircRNA分类

CircRNA是一类特殊的非编码RNA(Noncoding RNA)它的特殊性在于它并不是传统的5‘到3’的线性结构，而是长度在几百个碱基以上的闭合的环型结构[1]。在马铃薯中的RNA病毒、酵母菌[2]中发现circRNAs的时候认为它们是无意义的编码副产物[3]，但从小鼠精子决定基因中发现circRNAs可以进行转录后[4]，对circRNAs的研究便开始了新的时代，circRNAs的研究逐渐深入，其功能、特点、结构、形成方式等开始为人们所知。

根据形成方式的不同，内源性circRNAs可分为内含子circRNAs、外显子circRNAs和外显子-内含子circRNAs[5]。

1.1.1内含子形成的circRNA:内含子形成的circRNA通常是RNA 聚合酶将内含子从mRNA前体上剪切下来，内含子首尾相接成环形，这种circRNAs被称为环状内含子RNA(ciRNA)。ciRNAs主要存在于人类细胞。它的合成需要一个重要的位点:包含一个接近5′端，长度为7 nt 富含碱基G、U的拼接位点和RNA剪切分支位点附近11个nt的碱基C富集区域[6]。

1.1.2外显子形成的circRNA：外显子circRNA是目前研究最多的circRNAs，它们中一部分衍生自编码RNA的5‘或3’非翻译区(5‘UTR或3’UTR)，其他来自非编码RNA[7-8]。外显子circRNAs的形成有两种假说，第一种假说认为前体RNA在转录时越过了一段外显子，之后剪切酶在这段被越过的外显子两端进行切割，切割后的两端相连形成闭合的锁套结构(lariat)[9]。通过剪接会产生多种circRNAs: circRNAs可通过背接法(Back-Splicing)从单一的外显子衍生出来，也可由多个外显子经外拼接形成circRNAs。另一种假说认为RNA转录时外显子两端的内含子发生了碱基配对，由下游的外显子3′端尾巴连接到上游外显子5′端头部，下游3′剪接体结合上游5′剪接受体，使两个内含子结合，而环化的外显子被释放成为了circRNAs[10]。

1.1.3外显子和内含子片段组成的circRNA：许多细胞核内的circRNAs包含未剪接的内含子，这些circRNAs被称为外显子-内含子circRNAs(EIciRNA)[11]。EIciRNA大量存在于转录位点，如果去除EIciRNA则会降低亲本mRNA的表达，表明这些circRNAs可以促进亲本mRNA转录[12]。如EIciRNA可以与U1snRNP(U1核内核糖核蛋白)结合促进RNA 聚合酶 II与启动子相互作用从而增强基因转录[13]。

1.2 CircRNA特点

CircRNA具有稳定性高、分布广、进化相对保守、表达的时序性与特异性等特点。CircRNA不同于一般的线性RNA，是不含有poly A尾巴的5′、3′端闭合环状结构，没有核酸外切酶的切割位点，因而不易被酶切降解，这种结构稳定性使其在面对环境变化时对内环境稳态发挥重要作用。CircRNA在真核、原核生物[14]、类病毒、病毒、以及古生菌[15]中广泛存在。与其线性异构体[16]相比，circRNA的表达水平会高出10倍甚至更多。大部分circRNA存在于真核生物的细胞浆中，少数位于细胞核内[17]。CircRNA在进化上相对保守[18]，在不同物种中往往存在较多相似序列，从人脑中检出的circRNAs在小鼠、果蝇中都有相似序列，比如在小鼠体内发现的1 903个circRNA有81个在人类体内也存在相同的拷贝。比较猪、人和小鼠的circRNA序列发现20.20%的猪circRNAs具有人类直系同源物，而16.96%的猪circRNAs具有小鼠直系同源物。猪的circRNAs有29.4%在人体内有直系同源外显子[19]。在小鼠和人体内分别有1,510个circRNAs(25.45%)和5,189个circRNAs(87.44%)与家猪circRNAs有直系同源物。

CircRNAs在动物不同时期、不同组织的表达水平不同，具有发育阶段和组织特异性:在果蝇大脑中，有些circRNAs会随着年龄而增多。在线虫体内的上千种circRNAs中，不同时期的circRNAs表达数目和具体种类不同。血液中circRNAs的表达量高于肝脏和小脑，大部分血浆中的circRNAs存在于有膜脂包被的结构[20]，如外泌体和微小囊泡[21]。

2 CircRNA生物学功能

2.1 MiRNA分子海绵

许多circRNAs上有miRNAs结合位点，使其成为竞争性内源RNA，可以与miRNAs结合从而将miRNAs隔离。例如：miR-652-3p可以以结合编码基因的方式发挥作用调节线粒体功能，miR-652-3p靶向作用于MTP18，与其3'UTR序列互补结合。沉默其表达，对线粒体增殖和凋亡起到调控作用。而circRNA-MFACR通过结合miR-652-3p，促进MTP18mRNA翻译表达，调控心肌细胞中线粒体分裂和凋亡。即circRNA可以作为内源性“miRNA分子海绵”与miRNAs吸附在一起，使其丧失正常功能。“miRNA分子海绵”抑制miRNAs与靶基因结合的功能可以在不同基因组中表达，参与调节细胞miRNAs丰富度，是miRNAs介导的转录后调节网络的主要组分[22]。

2.2 编码蛋白/多肽功能

与传统认识的非编码RNA不同，部分circRNAs具有蛋白质或多肽编码功能， circ-ZNF609能够编码肌肉分化相关蛋白，该circRNAs从其宿主基因的第二外显子成环处生成，带有一个753nt的开放阅读框架(ORF)，它的UTR元件能驱动不依靠5'端帽子，而依靠IRES序列的顺式调控原件从circRNAs的中部启动并进行蛋白质翻译，但这种翻译速度要低于帽子端起始的正常翻译[23]。还有circRNAs可以在m6A甲基化修饰后驱动非帽子依赖性的翻译。与IRES序列相似，m6A甲基化区也能驱动circRNAs翻译，它可以识别YTHDF3蛋白，结合到circRNAs的修饰位点并吸引eIF4G2蛋白和其他翻译起始因子来驱动circRNAs的翻译[24]。m6A修饰的circRNAs还有高度的细胞特异性，即使是相同的circRNAs分子在不同的细胞中m6A修饰的状态也不尽相同。m6A一般倾向修饰大片段外显子circRNA。有一些circRNAs会与核糖体结合形成Ribo-circRNA复合物来影响编码，它们的UTR区有类似IRES的翻译驱动功能，但翻译效率较低[25]。CircRNAs的蛋白翻译功能的影响意义是巨大的，如circ-FBXW7可直接翻译蛋白FBXW7-185aa，与其母基因编码的FBXW7蛋白协同调控c-Myc的稳定性，抑制恶性胶质瘤的生长[26]。这种发现为circRNAs并非一般的非编码RNA提供了证据。

2.3 参与转录调控及表达

CircRNAs可以与蛋白质结合，或通过影响RNA剪接而与蛋白质发生关联，间接影响蛋白质的功能，起到调节转录或剪接的作用。外源性circRNAs通过内部的核糖体进入位点(IRES)或通过滚环扩增机制在体内或体外进行翻译[27]。植物体内circRNAs能在转录中参与R-Loop结构形成，拖慢转录的进行来影响RNA与RNA和DNA与RNA相互作用来实现调节基因表达，促进可变剪切的产生。在基因表达方面，circRNAs发挥类似mRNA的作用，通过与翻译起始位点结合或破坏成熟的线性RNA的完整性使线性转录物不翻译，EiciRNAs与RNA 聚合酶相互作用后与小核糖核蛋白结合，进而激活亲代基因的转录，抑制RNA-蛋白质相互作用并调节miRNAs的活性[28]。

2.4 CircRNA生物标志物与信号通路调节

细胞内的circRNAs会被分泌到细胞外泌体，由于circRNAs稳定且不易降解的特性，它在外泌体和血浆中的存在相当稳定且广泛。这为其作为疾病标志物奠定了基础。血液中的总circRNAs表达水平与神经组织十分相似，如：circRNA cdr1在阿尔茨海默病人血液中特异性表达[29]，与正常人相比直肠癌患者血液中就多出257种新circRNAs。而且与正常血清相比，这些癌症血清中circRNA-KLDHC10的表达水平明显升高[30]。MHCC-LM3型肝癌细胞中circRNAs与线性RNA的比例是普通细胞中的7倍[30]。可以说外泌体和血浆中稳定存在的circRNAs为诊断某些癌症提供了便利途径，circRNAs可作为一种可靠的疾病标志物发挥功能。

由于circRNAs不易被核酸酶降解的特性，可以在体外通过核酸酶处理去除线性RNA，得到高纯度的外源circRNAs之后用外源circRNAs转染发现细胞的自身免疫效应通路被激活，起到抑制病毒感染的作用，表明外源circRNAs在机体免疫等信号通路调节可能存在重要作用[31]。

3 CircRNA与骨相关疾病

3.1 CircRNA与骨关节疾病

关节炎(Osteoarthritis, OA)是一种由于软骨降解，骨质增厚，骨刺形成而引起的退行性关节病[32]。研究者通过circRNAs芯片对OA病人和正常人进行circRNAs差异表达筛选和ceRNAs网络共表达分析，在关节炎与正常软骨中，有71种circRNA、表达存在差异，circRNA_100876(circRNA-CER)、circRNA_100086、circRNA_101178和circRNA_101914等16个circRNA表达上调，另外55个表达下调，它们在软骨损伤和关节炎病情发展中可能有重要作用。其中，circRNA-CER可以被细胞白介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNFa)诱导表达上调，它通过内源性竞争miR-136来调控MMP13的表达，参与软骨细胞细胞外基质损伤过程。TNFa可以促进miR-193b的表达，miR-293b可以抑制早期软骨形成，而它调节早期软骨形成的靶基因IGF1R又可以被circRNA_0045714促进表达，由于基因IGF1R在早期软骨形成中的重要作用，circRNA_0045714在与关节炎疾病中也可能存在重要作用[33]。

3.2 CircRNA与成骨细胞和破骨细胞

成骨细胞和破骨细胞是骨形成的主要功能细胞，成骨细胞的分化由一系列激素、细胞因子和转录因子调控[16]，其中转录因子中的骨形成蛋白2(BMP2)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，是人体重要的细胞因子之一，也是异位骨和软骨形成的诱导剂[32]，在胚胎成长、细胞生长和分化及骨骼发育和骨折修复中起重要作用。经过BMP2处理的MC3T3-E1细胞中有158个circRNAs与正常细胞相比有表达差异，其中74种circRNAs上调，84种circRNA下调。通过qRT-PCR检验了4种circRNAs的表达情况，发现经过BMP2处理后，细胞中circRNA5846，circRNA19142和circRNA10042都显著上调。CircRNA5846和circRNA19 142分别与51种和21种miRNA有相互作用, 它们均与MiR-7067-5p作用行使miRNA海绵功能，且与FGF，EGF，PDGF和Wnt信号通路相关，可以参与细胞生长和分化[34]。BMP2可通过circ19142 / circ5846靶向miRNA-mRNA调节网络诱导成骨分化[34]。经BMP2处理组成骨分化相关因子ALP、SP7和RUNX2的mRNA表达水平显著增加。另外，CircRNA19142与miR-222-3p和miR-7067-5p相互作用[35]，而miR-222-3p能作为破骨细胞发生的抑制剂[26]。CircRNAs在小鼠破骨细胞生长的不同阶段也是不同的，在检测的1 797种circRNAs中，147种circRNA在前破骨细胞表达上调，109种表达下调；在成熟破骨细胞中，78种circRNA表达上调；在活化的破骨细胞中，111种circRNA和94种miRNAs表达上调[36]。

3.3 circRNA与其它非编码RNA与靶基因的作用

CircRNA-miRNA协同调节在破骨细胞形成过程中发挥重要作用。在协同调节网络中的miR-103受circRNA007873的上调和circRNA010763、circRNA015622的下调。Wnt1在骨、软骨发育中发挥重要作用，Wnt1是XV型(osteogenesis imperfect，OI)常染色体隐性遗传成骨不全的致病基因。目前已知的靶向Wnt1的miRNAs包括let-7e、miR-21、miR-34 a、miR-122、miR-148 a、miR-148b与miR-152等7种。针对以上miRNAs分析中与之相互作用的circRNAs、靶基因的生物信息学研究表明，这些miRNAs及其靶基因聚集在Focal adhesion、MAPK、Notch与TGF-beta信号通路， MAPK信号通路中发现DUSP1与MRPS35_hsa_circ_001042 均分别是与miR-21、miR-148 a、miR-148b及miR-152等4种miRNAs相互作用的靶基因与circRNA。ARHGAP35_hsa_circ_001101、KIAA0922_hsa_circ_001421与 PARP16_hsa_circ_000601与miR-34 a、miR-148 a、miR-148b和miR-1524等4种microRNAs分子相互作用，可能发挥分子海绵功能(Ref73)[37]。

4 总结与展望

综上所述，circRNA结构稳定，功能复杂，来源多样，分布广泛，未来关于其蛋白编码功能以及“miRNA分子海绵”功能仍有待进一步研究，目前对于circRNA与骨相关疾病的研究成果较少，但miRNAs与骨病已经有大量经过验证的功能，例如与成骨细胞相关的miR-222-3p和miR-7067-5p会被circRNA5846和circRNA19142调控。鉴于circRNAs与miRNAs之间可能存在的丰富的相互作用，circRNAs很可能通过与miRNAs的相互作用或是自身的编码能力对遗传性骨病产生影响。故对circRNAs的研究对骨相关病的成因以及基因层面的治疗都意义重大。