肠道菌群失调相关疾病及检测方法研究进展

张大永，王云，吕敏，张莉，刘静，谭玲，万军

自然界中的微生物分布广泛，数量庞大。人体内的肠道微生物更是多达1000亿以上，约占人体内寄居微生物总量的78%。肠道菌群与人体健康密不可分，主要表现在肠道菌群可影响人体的消化系统，肠-脑轴、肝-肠轴及中枢神经系统等。肠道微生物可分为三大类，第一类是有益菌，分布数量最多，约占总量的99%，代表菌群主要为乳杆菌、双歧杆菌；第二类是条件致病菌，只有当机体某种平衡被打破时，条件致病菌才可能对机体造成不利反应，主要为肠球菌、肠杆菌等；第三类是致病菌，常成为疾病发生的首要原因[1]，如铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等。肠道微生物组中共发现有9个门的细菌，包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌、梭杆菌科、疣微菌门、蓝细菌、螺旋体门和VadinBE97门[2]。一旦肠道菌群失调，将会引起机体相关疾病的出现。随着各种检测技术的快速发展，菌群检测分析技术的应用对于疾病的治疗有着重要意义。

1 菌群失调相关疾病

1.1 肥胖

随着人们生活方式和饮食结构不断变化，儿童因肥胖得病的概率逐年增加。肥胖不仅造成死亡率上升，还会阻碍心理与智力的发育。Million等[3]通过PCR 技术得出罗伊氏乳杆菌与肥胖有关。2011年，Everard等[4]通过实时荧光定量PCR、16SrRNA焦磷酸测序和基因芯片技术对摄入益生菌后的肥胖和糖尿病小鼠肠道菌群种类和数量的变化进行了深入研究。徐佩茹院长[5]曾对哈萨克族肥胖儿童进行过相关研究，即采用PCR-DGGE技术进行检测、回收、克隆并测序图谱上的优势条带，并根据DGGE图谱上的条带，呈现了肠道内的主要菌属序列，为肥胖与菌群关系的研究提供了新的方向。同时，从3～6岁肥胖儿童的粪便中提取脱氧核糖核酸(DNA) ，通过PCR扩增后进行基因测序，检测结果显示此年龄段肥胖儿童肠道中的变形菌门含量高，主要原因是日常饮食不规律，摄入过多高脂食物。

1.2 肠道炎症性疾病

据现有文献报道，肠道菌群与炎性肠病密切相关[6]。曾有人[7]利用荧光定量PCR技术测定轮状病毒肠炎患儿与健康儿童肠道菌群细菌的16SrRNA，结果显示轮状病毒肠炎患儿与健康儿童肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌数量有较大差异，且轮状病毒肠炎患儿肠道中益生菌的数量明显减少。Kassinen等[8]通过16SrRNA 探针杂交发现IBS（肠易激综合征）有明显的菌群改变, 主要菌群为粪肠球菌、柯林氏菌和粪肠杆菌。Kerckhoffs 等[9]通过定量PCR法分析双歧杆菌的组成，发现IBS患者十二指肠刷片和粪便菌群中链状双歧杆菌显著降低。Tana等[10]的研究也证实IBS患者粪便中韦荣球菌的数量有明显的增加。Krogius-Kurikka 等[11]运用定量PCR技术进一步发现腹泻型IBS 患者粪便菌群中蛋白菌和梭菌属细菌增多，而放线菌属和拟杆菌属减少。Matto等[12]运用 PCR-DGGE发现IBS患者类大肠菌群较正常人群明显增多，需氧菌/厌氧菌比值亦明显升高。Bjerketorp等[13]将基因芯片与长度异质性PCR(LH-PCR)相结合，结果表明抗生素使用期间部分肠道细菌出现增减变化。Nelson等[14]采用 PhyloChip 技术(针对16SrRNA的基因芯片)对便秘型IBS大鼠模型结直肠内的细菌进行研究，结果表明细菌种类增加，硬壁菌门细菌与拟杆菌属之比明显改变，拟杆菌属明显增加。

1.3 糖尿病

根据相关文献和实验分析，糖尿病的患者可能会出现肠道菌群失调；其中，1型糖尿病（T1DM）目前认为主要与遗传、免疫、环境等因素有关[15]。Alkanani 等[16]运用高通量测序技术，发现T1DM 患者体内的拟杆菌属细菌丰度升高，普雷沃氏菌属细菌丰度下降，一些有益菌群含量减少[17]。Wirth 等[18]通过 DNA 测序分析发现，在T1DM 大鼠的回肠段，菌群的丰度和多样性发生了较大的改变。Patterson等[19]用高通量 16SrRNA 测序技术研究SD大鼠肠道菌群的组成。目前研究还认为，菌群失调与2型糖尿病（T2DM）患者有着某种联系。Qin[20]通过两阶段宏基因组关联分析，确定了中国 T2DM 患者与非糖尿病患者在肠道菌群结构上存在差异。Larsen等[21]采用454焦磷酸测序技术发现 2型糖尿病（T2DM）患者的肠道内拟杆菌门与厚壁菌门的数量均明显低于正常人。Zhang等[22]利用基于16SrRNA 的高通量测序技术对T2DM患者的肠道菌群进行检测，发现疣微菌科细菌和梭菌科细菌L2-6等产生丁酸的细菌比正常人肠道内细菌具有较好的丰度。对于妊娠糖尿病（GDM）与肠道菌群的研究，Fugmann 等[23]对GDM 患者的肠道菌群16SrRNA 进行高通量测序后发现，GDM 患者体内拟杆菌门普雷沃氏菌丰度显著升高，厚壁菌门细菌丰度显著下降。通过对T1DM、T2DM和GDM这三种类型糖尿病患者的肠道菌群的检测，阐明糖尿病的发生与肠道菌群失调有密切关联。

1.4 非酒精性脂肪性肝病

肠道和肝脏在人体组织器官中相互影响。首先，肝脏分泌的胆汁使肠道维持正常的消化吸收功能，而肠道则提供给肝脏70%血液供应[24]。此外，肝脏与肠道菌群之间也有着密不可分的关系。在正常机体中，肝脏可以清除肠道中的各种毒素，而肠道内正常的微生物菌群可以保证肝脏的正常运转[25]。1998年Marshall[26]首次正式提出了“肠-肝轴”学说，进一步说明肝病与肠道菌群失调有关。黄红丽[27]等对NAFLD大鼠盲肠黏膜组织的DNA进行16SrDNA高通量Illumina测序检测肠道微生态变化，结果显示模型组厚壁菌门/拟杆菌门的比值下降，而疣微菌门的比例上升。

2 肠道菌群的检测技术

目前，常用的肠道菌群检测方法有PCR技术、16SrDNA分子测序技术和荧光原位杂交技术，并针对这三种检测技术的进展进行综述。

2.1 PCR技术

PCR技术也称聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加，RAPD，ERIC-PCR和AFLP是常见的三种PCR反应方法。刘丹[28]等利用RAPD 、ERIC-PCR 及REP指纹图谱分析43 株来源于不同患者的多重耐药鲍曼不动杆菌，结果说明其具有同源性较近的特征。Gnat S[29]利用RAPD，ERIC-PCR和AFLP指纹图谱分析了28种黄芪共生菌基因组多样性与亲缘关系。Torriani S[30]利用RAPD-PCR和AFLP技术分别对23株植物乳杆菌、3株戊糖乳杆菌及2株不明显的相关菌株进行研究。Gueimonde M[31]采用PCR技术定量和定性的对双歧杆菌微生物群的组成进行实时评估。Relman DA[32]分别选用广谱引物和特异性引物，采用PCR反应直接从五名惠普尔病患者的组织中扩增细菌16SrRNA序列，确定并分析了扩增产物的核苷酸序列，结果显示惠普尔病患者的发病与体内一种革兰氏阳性放线菌有关。

2.2 16S rDNA分子测序技术

16S rRNA分子工具的发展已经成为20世纪后期临床微生物学最重要的进展[33]。有效细菌物种名称的快速增长直接关系到16S rRNA测序的表现[34]。Drancourt等描述的138种细菌种类中通过16S rRNA扩增在物种水平上进行样品鉴定和测序的占58.7%。16S rRNA扩增和测序可用来描述新的细菌种类和培养的细菌[35]，并提高了细菌鉴定效率。2009 年，HusenZhang 等[36]通过16S rDNA-PCR及高通量测序技术对比分析了肥胖者和正常人的肠道菌群结构差异。Ley R E[37]通过16SrDNA分子测序技术分析遗传肥胖小鼠、瘦小鼠及母亲的菌群结构，结果表明小鼠和人类微生物群相似，均以厚壁菌和类杆菌为主；微生物群落组成从母亲继承；与瘦小鼠相比，无论亲缘关系如何，遗传肥胖小鼠的拟杆菌丰度降低50%，且厚壁菌增加；表明肥胖会影响肠道菌群的多样性。Sleigh J[38]利用16S rDNA聚合酶链式反应和DNA测序检测危重病人的菌血症。Tajima K[39]通过对禁食16h的荷斯坦奶牛瘤胃内16S rDNA克隆文库进行PCR扩增和测序，分析瘤胃细菌的分子多样性。在来自瘤胃液的文库中，序列与下列主要门有关：低G + C革兰氏阳性菌（52.4%），细胞色素类拟杆菌（38.1%），变形菌（4.7%），螺旋体（2.4%）和2.4%有不确定的归属关系。Mcauliffe L[40]采用基于16S rRNA基因与支原体特异性引物的PCR进行新诊断测试的发展，并使用变性梯度凝胶电泳（DGGE）根据初级序列分离PCR产物，24h内即可直接从临床样品中诊断支原体感染。Lagier[41]通过16S rRNA技术鉴定出29种新的细菌种类和16种从人类分离的细菌种类。

2.4 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术（FISH）基于来自微生物的特定核苷酸序列与荧光标记探针的杂交，并且该技术已被用于检测特定微生物。由于其特异性、快速性和敏感性，FISH被认为是微生物学中各种应用的可靠方法[42]。 Langendijk[43]采用荧光原位杂交技术分析乳糖不耐受者结肠菌群的构成，旨在探讨其与不耐受症状之间的关系。 Vonk RJ[44]在这一基础上应用荧光原位杂交技术检测出结肠细菌总数和双歧杆菌数可能与乳糖不耐受者症状的产生有关。PSLangendijk[45]和Moter[46]采用了16SrDNA荧光原位杂交技术分析了人粪样本中的菌群结构，说明16SrDNA荧光原位杂交技术可用来进行可视化研究，对可培养及不可培养的微生物均可进行探测，并分析肠道菌群的空间结构。

3 小结与讨论

近年来，越来越多的研究证明，肠道菌群与人体机能及生理结构关系密切。肠道菌群失调不仅会引起肠道方面的疾病，更可以通过肝肠轴、脑肠轴及肝胆的密切关系引起肝病、精神系统疾病、胆炎等与之相关的疾病。因此，选择合适的检测技术对于了解肠道菌群结构、治疗相关疾病有着重要意义。肠道菌群的检测手段主要有传统的纯培养法、ERIC-PCR分子杂交技术、测序技术和荧光原位杂交技术等。动物肠道菌群结构的检测方法经历了从传统培养到现代分子生物学方法的过程，但仍未能完全详细地将肠道菌群结构的种类、数量和功能基因分析清楚，只能达到对优势菌群的宏观了解。各种分析方法既具有其优越性又存在局限性，只有将传统培养方法和分子生物学方法相结合，才会更有利于肠道菌群结构的分析及疾病的治疗。