中药发育毒性研究进展

唐欣，谢晓芳，饶朝龙，彭成

发育毒理学（developmental toxicology）是在实验畸胎学基础上发展起来的毒理学的一个分支学科，主要关注药物的发育毒性（developmental toxicity）。发育毒性是指由影响正常生长、机体稳态、发育、分化和/或行为的化学物质或物理因素所造成的任何形态或功能改变[1]，包括了传统“三致”毒性中的“致畸”作用和胚胎毒性。目前，外源化学物发育毒性的评价主要包括三个方面，即哺乳动物发育毒性试验、人群流行病学调查和发育毒性替代试验[2]。其中，在实验室研究中主要开展整体动物发育毒性试验和替代试验。中药在中医临床实践已有数千年的历史，传统上认为中药作用相对温和，且按照理法方药的原则进行配伍，不良反应较少，因此中药在国内外妊娠期妇女中的使用比较普遍。自20世纪五六十年代震惊世界的“反应停”事件之后，人们对妊娠期间使用药物的谨慎性明显增加[3～5]。由于历史条件的局限性，传统医药著作对中药妊娠禁忌的记载仍然来源于临床使用经验，缺乏严谨系统的研究[6]。随着中药剂型的增多及用法、用量发生变化，部分中药经提取精制后，有效成分及有毒成分相对云集，在疗效提高的同时，可能会致使相对的毒性增强或产生新的毒性[7～9]。如何避免中药的发育毒性和致畸作用，保证中药在孕妇、妊娠和哺乳期女性中的安全、科学用药，按照现代发育毒性的认识和方法，开展中药发育毒性研究是中医药现代化和中医现代临床的迫切需求。本文通过整理近年来的国内外相关文献，对药物发育毒性的研究方法进行疏理，并以之概述中药发育毒性研究现状。

1 发育毒性的研究方法

发育毒性的研究方法大体分为两大类，即体内生殖发育毒性试验和体外替代试验。此外，流行病学调查也是重要的化合物毒性评价手段。药品注册技术要求国际协调会(ICH)和我国新药临床前研究指南有关发育生育毒性试验的规定大体上一致,即在体内发育毒性方面将之分为3阶段试验：①生育力与早期胚胎发育毒性试验，又称一般生殖毒性试验；②胚胎-胎仔发育毒性试验，即致畸试验；③出生前后发育毒性试验，即围生期毒性试验[10]。在体外替代实验方法中，20世纪90年代末，欧洲替代方法研究中心(ECVAM)推荐有效性较高的3个体外胚胎发育毒性筛选试验作为体外筛选的首选方法，即体外全胚胎培养(whole embryo culture，WEC)试验、胚胎细胞微团培养(embryonic cell micromass culture，MM)试验和胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test，EST)[11～13]。在研究技术上，荧光原位杂交技术、彗星试验、小鼠骨髓细胞微核分析试验等常用检测方法也可应用于中药胚胎毒性的相关研究中[6]。随着模式动物斑马鱼在现代生命科学研究中的应用，近年来也被应用于发育毒性研究。

2 中药发育毒性认识的演变

中药发育毒性研究是中药安全性研究的重要组成部分。与传统中医理论中妊娠禁忌不同,现代所说的中药发育生殖毒性不仅包括药物致流产、胎儿死亡,还包括药物对受胎能力、生殖系统、胚胎发育及胎仔出生后发育的潜在不良影响,以及药物诱导畸胎产生的可能性[3]。而胚胎毒性(Embryo toxicity)通常是指外源性因素对胚胎的选择毒性作用，表现为妊娠着床前早期阶段或着床后段胚胎的丢失，或出生前引发的在胎儿期观察到任何毒性表现。胚胎毒性虽然是在宫内引发的，但表现在出生前或出生后的发育过程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宫内、胎儿生长受限、功能缺陷和畸形等[3]。畸形只是胚胎毒性的一种，从广义上讲，生殖毒性试验又将致畸试验包括在内[7]。中药胚胎毒性的研究在20世纪五六十年代除了文献整理以外,实验室研究的重点在于妊娠禁忌药是否存在,且大多局限于流产、堕胎等中断妊娠效果[8]。经过几十年的发展,随着胚胎毒性的定义不断变化和药物毒性的中药毒性研究的规范化，,中药的胚胎毒性已不仅仅是指妊娠禁忌药,同时还引申到生殖发育毒性和遗传毒性[9]。

3 体内发育毒性试验方法及中药研究进展

3.1 试验方法

体内发育毒性试验分为Ⅲ段：生育力与早期胚胎发育毒性试验（Ⅰ段）、胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）和出生前后发育毒性试验（Ⅲ段）。其中Ⅰ段试验于妊娠前和妊娠初期给药,以检测受试物对动物的生育力及早期胚胎发育的影响。在Ⅰ段试验中,雄性动物给药4～10周，雌性给药2周,雄性动物给药期应持续整个交配期直至处死,雌性动物至少应持续至胚胎着床(妊娠第6～7天)。观察动物体征、体重、摄食量变化,检查药物是否对动物的交配情况产生影响,尸检过程中着重检查动物生殖器官的变化,并进行精子活力和着床情况检查。Ⅱ段试验于胎儿器官发生期给药,以检测受试物可能的胚胎毒性和致畸性。大鼠妊娠第6～15天给药,家兔妊娠第6～18天给药。观察动物体征、体重、摄食量变化,尸检过程中着重检查孕鼠受胎情况,测量胎仔体重和身长。Ⅲ段试验于围产期和哺乳期给药,以检测受试物对分娩、哺乳以及胎儿晚期发育、出生后生长和发育的可能影响。动物在妊娠第15天至离乳期间给药。观察动物体征、体重、摄食量变化,观察药物对孕鼠分娩的影响并对子代动物存活、生长发育和行为情况进行观察[5,14]。

3.2 研究进展

周莉[15]分别以1，5，15 g·kg-1红花如意丸灌胃着床至硬腭闭合期间的SD妊娠大鼠，结果发现红花如意丸对孕鼠的妊娠结局(平均黄体数和死胎率等)和胎仔的外观、内脏和体格生长发育(窝均体重、身长、尾长和胎盘重)均未见明显影响；但对母鼠有毒性，主要表现为5和15 g·kg-1组母鼠体重增长缓慢和宫外增重减少；对胚胎-胎仔发育毒性表现为15 g·kg-1组活胎率降低，吸收胎率增加，以及5和15 g·kg-1组胎仔胸骨节骨化点发育迟缓。岳苹[16]以2.275 g·kg-1生半夏汤及5.688 g·kg-1干姜人参半夏汤灌胃未孕小鼠及致畸敏感期孕鼠，结果未孕小鼠给药14 d后和致畸敏感期孕鼠给药10 d，均未出现异常。宋翼升[17]对孕6～15天SD大鼠灌胃云南白药连续10天，剂量为4，1.4，0.5 g·kg-1，结果云南白药可导致一定母体毒性，高剂量组大鼠给药后出现流涎、活动减少，部分打嗝、打喷嚏、挠嘴、呼吸音加粗，但上述异常可逆。周国亮[18]以相同剂量的云南白药灌胃大鼠，从交配前到交配期直至胚胎着床期间均给药，结果各剂量组雄鼠体重增长缓慢，有剂量和时间关系，且高、中、低剂量组睾丸系数及高剂量组的附睾系数、前列腺系数均显著升高，表明云南白药有一定亲代毒性；但各剂量组交配率、妊娠率、合笼天数、子宫连胎重、黄体数、着床数、着床前丢失数、活胎数、死胎数、吸收胎数等胚胎形成指标与阴性对照组比较均无显著性差异，表明对大鼠生育力和早期胚胎发育无影响。陈蓉芳[19]以10，30，90 mg·kg-1剂量于妊娠胎鼠器官形成期连续灌胃雷公藤提取物10天，在妊娠20天剖宫观察，发现雷公藤提取物在90 mg·kg-1剂量时出现明显的母体毒性和胚胎毒性,表现为母鼠体重增加值比对照组小；死胎率及吸收胎率增高,活胎率降低；30 mg·kg-1剂量时出现胎儿毒性，表现为胎儿体重、身长较小、胸骨缺失和骨化迟缓；未观察到胎儿畸形。王海凤[20]给妊娠第3天小鼠连续5天灌胃大黄水提取物7，5，2.5 g·kg-1，于孕第12天采血处死小鼠，结果随着大黄水提取物剂量的增加，小鼠的流产率逐渐上升，7 g·kg-1处理组小鼠100%流产，检测显示血清雌激素和孕激素含量呈下降趋势，细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2含量不同程度增加，同时肥大细胞和巨噬细胞数量显著增加，结果表明大黄水提取物具有发育毒性。

4 体外替代试验方法及中药研究进展

4.1 体外全胚胎培养

体外全胚胎培养( whole embryo culture，WEC)是1934年Nicholas始创的实验方法，目前已成为研究各种药物及化合物胚胎毒性和生殖毒性的经典替代方法之一。1981年，Brown NA等利用大鼠体外胚胎培养手段制定了评价胚胎形态发育学和生长分化情况的评分系统，并以此作为评价胚胎发育和致畸性研究的一个指标[21]。全胚胎培养技术是指将已在动物体内形成的胚胎取出后置于含有不同浓度药物的体外培养液中，经过一段时间的培育收获胚胎，评估每个胚胎整体发育和神经系统发育情况，通过胚胎生长发育指标和形态分化指标等对药物的胚胎发育毒性作用进行评价。肖凯[22]应用大鼠着床后体外全胚胎培养模型，将9.5天SD大鼠胚胎与含生草乌终浓度分别为：0、0.63、1.25、2.5和5 mg生药/mL的大鼠即刻离心血清共培养48 h，结果发现生草乌最大无作用剂量为1.25 mg·mL-1，且2.5 mg·mL-1以上剂量可诱发卵黄囊生长和血管分化不良、生长迟缓及形态分化异常，严重者出现体节紊乱、小头、心脏发育迟滞(心小,停留在心管期)及心脏空泡等。表明较高剂量生草乌对体外培养大鼠胚胎具有一定的毒性作用,建议孕妇妊娠期间(特别是妊娠前3个月)慎用或禁用草乌。韩佳寅[23]采用小鼠全胚胎培养模型探讨千里光的胚胎发育毒性，将8.5天小鼠胚胎从母体分离后,在含有千里光菲灵碱终浓度12.5，25，50和10 µg·mL-1和克氏千里光碱终浓度为12.5，25和50 µg·mL-1的血清中培养48 h，结果给药后，VYS（脏层卵黄囊）直径、颅臀长、头长及体节数等胚胎生长发育指标值和VYS循环、尿囊、翻转、心、脑、尾神经管、视听嗅系统、腮弓、颌突及肢芽等胚胎器官形态分化指标评分均较溶媒对照组有所降低，其毒性作用呈一定的量效关系，表明二者对离体胚胎的生长发育和形态分化均产生抑制。

4.2 胚胎细胞微团培养

胚胎细胞微团培养是20世纪80年代由Flint建立，并经Renault等加以改善的体外培养试验系统，已广泛应用于胚胎毒物筛检。其理论基础在于一些毒性物质影响靶器官或靶组织细胞的分化、增殖、迁移及基质的改变，而这些改变可通过未分化细胞的体外培养表现出来，从而根据培养细胞集落形成数量、细胞形态、基质变化和超微结构的变化评价化学物质的毒性作用及其机制。1991年Daston等[24]应用鸡胚神经视网膜细胞（CERC）进行聚集物原代培养。目前为止，已建立鸡、小鼠或大鼠肢芽细胞和中脑细胞等微团培养方法用于发育毒性的研究。

WilkZasadna等[25]通过对大鼠中脑细胞微团的培养研究赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的毒性作用及机制。结果表明，OTA是一种强烈的致畸剂，其ID50＜10 mg·L-1，免疫评估显示OTA对神经元细胞、星形胶质细胞的特殊选择毒性；形态测量学评估通过计算机图像分析，显示致畸潜能与OTA影响神经细胞的聚集有关。Tahereh TALAEI-KHOZANI等[26]观察了夹竹桃提取物对小鼠肢芽软骨形成和骨形成的影响，发现10 µg·mL-1的夹竹桃提取物能降低小鼠肢芽的软骨形成，但对骨形成无影响，而更高浓度的夹竹桃提取物对小鼠肢芽的软骨形成和骨形成却均影响，原因不明。

4.3 胚胎干细胞

胚胎干细胞实验(Embryonicstem cell test，EST)是1997年由Horst Spielmann最先发展起来的，自从1981年Evans等成功地从小鼠早期胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出ESC以来[27～28]，研究者纷纷利用ESC的体外特性从细胞毒性、分化抑制和基因表达等不同水平评价药物的潜在胚胎毒性和致畸性。可从ES细胞毒性、成纤维细胞毒性、抑制ES细胞分化为心肌细胞等角度干细胞研究是目前国内外生命科学研究的热点和前沿课题,利用胚胎干细胞建立发育毒物体外预测模型,可评价药物的潜在胚胎毒性和致畸性[29]。目前干细胞在中药研究的应用主要集中在中药对干细胞分化和增殖的影响作用方面,由于用胚胎细胞进行毒理学研究可以克服传统的体内和体外细胞毒性试验的不足,同时人类胚胎细胞的应用,又可避免种属差异,解决实验动物结果向人外推的最大难题,因此将来源于人的胚胎干细胞引入中药胚胎毒理学的研究,必将成为该领域重要的研究工具。

岳苹[30]采用小鼠胚胎干细胞（mESC）观察生半夏汤（粉）、干姜人参半夏汤（粉）的含药血清的毒性，结果发现生半夏汤（粉）含药血清可制体外mESC向心肌细胞的分化，干姜人参半夏汤（粉）含药血清则无此作用。王键[31]通过研究中药单体黄芩苷、葛根素和人参皂苷R1是否通过改变小鼠胚胎干细胞家族miR-290成员的表达影响D3系小鼠胚胎干细胞的增殖能力，结果表明黄芩苷通过下调miR-294进而抑制原癌基因c-jun和c-fos的表达从而抑制ESCs的增殖。

5 斑马鱼在中药发育毒性研究中的应用

斑马鱼（zebrafish，Daniorerio）作为一种模式动物，已经被广泛应用于遗传学和发育生物学研究。近些年，斑马鱼的研究已经拓展和延伸到中药领域。斑马鱼被称为是21世纪新型毒性评价模型[32]，并得到国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）、经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）以及欧洲化妆品毒理学和生态毒理学中心（European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals，ECETOC）等权威组织的认可，被推荐为新的替代动物[33]。作为一种整体动物模型，斑马鱼能够全面地检测、评估中药的活性和毒性，进而实现高通量筛选[34～38]。如许冰洁等[39]用斑马鱼胚胎评价5种已知对人类胚胎致畸药物的毒性与安全性，证实斑马鱼胚胎模型可用于初步评价药物的发育毒性和安全性。

国内学者已开始利用斑马鱼评价中药发育毒性。何育霖[40]将受精后0，10，24，48 h( hours post fertilization，hpf)发育正常的斑马鱼胚胎分别置于含有不同剂量紫草素的胚胎培养液中12，24，36，48 h，结果发现，紫草素在12 h内引起斑马鱼的发育畸形，此外可引起斑马鱼幼鱼心率减慢和抑制血管形成。何贝轩[41]用梯度浓度的木香挥发油处理2，12，24 hpf的斑马鱼，结果发现木香挥发油对斑马鱼胚胎发育有一定毒性，而且对发育期早期的毒性更大。

6 总结

随着中药广泛应用与临床并发挥治疗作用，其毒副作用和不良反应也日益受到关注，其中生殖发育毒性备受关注。建立一个完善的中药发育毒性评价体系,对古代医家论述的妊娠禁忌药重新评价和认识,对现代报道具胚胎毒性作用的中药进一步研究核实,是一项刻不容缓的工作。我们也要认识到实验结论是为人类健康服务的，鉴于其他种属或离体组织与妊娠人体的差异，因而从人体得到的结论更有说服力。通过加强病例报告制度和大规模流行病学调查，对妊娠期使用中药的结局进行回顾性分析，都将有助于提高妊娠期使用中药的安全性[42]。相信现代科技的迅猛发展将为中药胚胎毒性的标准化和规范化评价提供良好的实现条件,中药胚胎毒性研究也有望借此得以新的突破。