活性肽荞茶饮料配方研究

谭萍，方玉梅，周斯弼

（六盘水师范学院，贵州六盘水553004）

苦荞麦，蓼科双子叶植物，俗称苦荞。一年生草本植物。我国大量种植苦荞麦，现种植面积及产量居全球第一[1]。性味苦、平、寒是苦荞麦的特征，且有益气、提神、降气、健胃、利耳明目等作用，生理功能有防治冠心病、降血糖、高血压、抗菌、抗病毒、抗癌、防止内出血、免疫调节、延缓衰老等多种功能[2-4]。根据研究表明苦荞麦中富含的活性肽与生理功能和药用价值有一定的关联。

近几年来，活性肽已引起了世界各国家食品营养及医学界的关注。如我国王竹清[5]等研究了生物活性肽及其研究进展；崔霞[6]等研究酶法水解苦荞麦活性肽有7种人体必需氨基酸；崔霞[2]等研究了苦荞麦活性肽的研究现状及发展趋势；安毅[7]等研究大豆蛋白活性肽在功能性食品中的应用及发展前景；张宇昊[8]等研究花生短肽降血压活性；郭晓娜[9]等研究苦荞麦蛋白质酶解产物的抗氧化活性研究。综上所述，活性肽具有降血压、抗氧化、免疫调节等多种功能。

由于活性肽具有多种生理功能，许多研究者将活性肽用于饮料研究。例如：李侠[10]等研制大豆-荞麦多肽复合营养饮料；马龙[11]等研究鸡骨多肽保健饮品工艺；巩婷婷[12]等研究大豆活性肽饮料；范镇基[13]等研究玉米肽解酒饮料；马平[14]等研究人参乳清蛋白多肽饮料的稳定性及活性；谭斌[15]等研究橙汁花生肽饮料、鲍九枝[16]等研究大鲵肉活性肽饮料等。但对苦荞麦活性肽饮料的研究很少，目前苦荞麦加工制作的产品主要以苦荞茶、荞麦面包、荞酥、苦荞醋等初级加工产品为主，只有周小理[1]等研究苦荞多肽营养饮料，但该饮料尚未形成产品上市。本研究以此为切入点深入研究活性肽荞茶饮料，不仅满足市场对苦荞麦活性肽产品多样化的需求，而且对荞麦的深加工和开发我国荞麦特色资源具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞麦肽：六盘水师范学院生命科学系植物生理实验室所制；荞麦：六苦4号；蜂蜜：惠宜-蜂蜜-兰溪市鸿香生物科技有限公司；胰蛋白胨：北京力高兴业科技有限公司；酵母浸膏：济南杰辉商贸有限公司；葡萄糖：新沂市英会工贸有限责任公司；琼脂：河南中偌生物科技有限公司；DPPH：西安热默尔生物科技有限公司；无水乙醇：苏州市禄浩化工原料有限公司。

1.2 试验仪器

三洋高压灭菌锅：SANYO；万能电炉：深圳市宝安区新安晶艺电热器设备商行；PHS-2C精密酸度计：上海虹益仪器表有限公司；FA2014电子天平：重庆市松朗电子仪器有限公司；TDZ5台式低速离心机：苏州业之峰离心机制造有限公司；722型可见分光光度计：上海驰唐仪器：实业有限公司；DHP-9270B恒温培养箱：北京林茂科技有限公司；202A-3型数显电热恒温干燥箱：东莞市华凯检测设备科技有限公司；JJ-CJ-2F超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 活性肽荞茶饮料工艺流程

1.3.2 活性肽荞茶饮料感官评价

根据饮料感官评定标准[17]，设计活性肽荞茶饮料感官评价表，由对饮料感官评价标准熟悉的10位实验室人员（♂：5、♀：5）进行评分，满分 100 分，感官评价标准见表1。

表1 活性肽荞茶饮料感官评价标准Table 1 Active peptide buckwheat tea beverage sensory evaluation criteria

1.3.3 活性肽荞茶饮料配方单因素试验

影响活性肽荞茶饮料的因素有苦荞茶的添加量，苦荞麦肽、蜂蜜的添加量，通过设计单因素试验来确定影响活性肽荞茶饮料的各个因素的添加量。

1.3.3.1 自制苦荞茶

苦荞米经清洗、烘干、炒制后得到自制苦荞茶。

1.3.3.2 苦荞茶添加量对活性肽荞茶饮料感官的影响

取苦荞麦活性肽添加量为1.5%、蜂蜜的添加量为4%，苦荞茶添加量分别为3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦荞茶与其混合均匀。根据感官评价标准确定苦荞茶最佳添加量。

1.3.3.3 蜂蜜的添加量对活性肽荞茶饮料感官的影响

苦荞麦活性肽添加量为1.5%、苦荞茶的添加量为5%，蜂蜜添加量分别为3%、4%、5%、6%、7%，并取100 mL苦荞茶与其混合均匀。根据感官评价标准确定蜂蜜最佳添加量。

1.3.3.4 苦荞麦活性肽添加量对活性肽荞茶饮料感官的影响

苦荞茶添加量为5%、蜂蜜的添加量为4%，苦荞茶活性肽添加量分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，并取100 mL苦荞茶与其混合均匀。根据感官评价标准确定苦荞茶活性肽最佳添加量。

1.3.4 活性肽荞茶饮料配方正交试验

为了获得活性肽荞茶饮料的最佳配方，根据单因素试验所确定的苦荞活性肽、苦荞茶、蜂蜜的最适添加量，对苦荞活性肽、苦荞茶、蜂蜜添加量进行L9（33）正交设计如表2，通过感官评价分析确定饮料中苦荞活性肽、苦荞茶、蜂蜜的添加量。

表2 L9（33）正交试验设计因素水平表Table 2 L9（33）Level table of orthogonal experimental design factors

1.3.5 灭菌条件对活性肽荞茶饮料感官的影响

王若敏[18]等报道活性肽较稳定，在80℃～100℃条件下活性有最高值，为保证苦荞麦活性肽的功能性，活性肽荞茶饮料的灭菌条件设计为75℃20 min、85℃20 min、95 ℃ 20 min、105 ℃ 20 min、115 ℃ 20 min，根据感官评价标准确定最适的灭菌条件。

1.3.6 活性肽荞茶饮料微生物检测

按照GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，微生物检测标准：菌落总数≤100 CFU/mL。微生物检测步骤[19-20]：配制平板计数琼脂（PCA）培养基，无菌操作条件下，将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可以放在46℃左右的恒温水浴保温）倒入培养皿，用移液枪取经过灭菌的活性肽荞茶饮料1 mL注入培养基平板内，并转动培养皿使其混合均匀。同时，分别吸取1mL无菌水加入培养基内作空白对照。等待琼脂凝固后，将平板翻转，28℃恒温培养箱中培养（72±3）h观察。观察菌落时可用肉眼观察，在必要的条件下可用放大镜或菌落计数器，记录相应的菌落数量。

平板计数琼脂培养基成分：2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母浸膏、0.5 g葡萄糖、7.5 g琼脂、500 mL蒸馏水、pH（7.0±0.2）。制作方法：将以上成分加于装有500 mL蒸馏水的烧杯中，用万能电炉煮沸溶解，精密酸度计调节pH值。然后用锥形瓶分装，121℃高压灭菌15 min

1.3.7 活性肽荞茶饮料的抗氧化性检测

根据谭萍[21]、Thammarat Aree[22]等报道的DPPH自由基清除法，配制DPPH母溶液，准确称取0.044 g DPPH，用无水乙醇溶解并定容到100 mL容量瓶里，配制成120 μmol/LDPPH母液在0℃～4℃下避光保存备用。

DPPH工作液的配制是用量筒量取10 mL母液后用无水乙醇稀释10倍即用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中。

对照组：取2 mL无水乙醇和4 mLDPPH工作液混合同一试管中，摇匀后放置在黑暗处避光30 min，以无水乙醇为空白对照，在波长为517 nm处测定其吸光度值Ai。

试验组：取2 mL活性肽荞茶饮料成品和4 mL DPPH工作液加入同一试管中混合，摇匀后放置在黑暗处避光30 min，以无水乙醇为空白对照，在波长为517 nm处测定其吸光度值Aj。所测得吸光度按照下列公式计算清除率：

式中：Ai为DPPH与溶剂混合后的吸光值；Aj为DPPH和样液反应后的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验的结果与分析

2.1.1 苦荞茶添加量对活性肽荞茶饮料口感的影响

苦荞麦活性肽添加量1.5%、蜂蜜添加量4%，苦荞茶添加量设计5个添加量梯度为3%、4%、5%、6%、7%。根据感官评价标准进行综合评分见图1。

图1 苦荞茶添加量的感官评分图Fig.1 Sensory scoring of addition amount in tartary buckwheat tea

苦荞茶添加量为5%时感官评分最高，即活性肽荞茶饮料的颜色为亮黄色、气味适中、口感好无苦涩、液体状态均匀；苦荞麦添加量少于5%时苦荞茶的香味偏淡，当添加量大于5%时有苦味和涩味。因此苦荞茶的最适添加量选为5%。

2.1.2 蜂蜜的添加量对活性肽荞茶饮料口感的影响

苦荞麦活性肽添加量1.5%、苦荞麦添加量5%，蜂蜜添加量设计5个梯度为3%、4%、5%、6%、7%，根据感官评价综合评分见图2。

图2 蜂蜜添加量的感官评分图Fig.2 Sensory scoring of addition amount in honey

蜂蜜添加量为4%感官评分最高，当蜂蜜添加量为3%时色泽及液体状态均良好、口感明显降低，即甜味过淡且苦荞麦活性肽味没有很好的掩盖；当蜂蜜添加量大于4%时口感偏甜，感官评分下降。当蜂蜜添加量为4%时，活性肽荞茶饮料的颜色、气味、口感、液体状态最佳，因此蜂蜜的最适添加量为4%。

2.1.3 苦荞麦活性肽添加量对活性肽荞茶饮料口感的影响

苦荞茶添加量5%、蜂蜜添加量4%，苦荞麦活性肽添加量设计5个添加量梯度为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，根据感官评价标准进行综合评分见图3。

图3 苦荞麦活性肽添加量的感官评分图Fig.3 Sensory scoring of addition amount in buckwheat active peptide

苦荞麦活性肽添加量不断增加时，添加量为1.5%感官评分最高。苦荞麦活性肽添加量过低饮料香气、口感偏淡，苦荞麦活性肽添加量过高则肽味明显。当苦荞麦活性肽添加量为1.5%时感官评分最高，饮料的颜色、气味、口感、液体状态最佳，因此苦荞麦活性肽的最适添加量选为1.5%。

2.2 正交试验的结果与分析

正交试验的设计是在单因素所得结果的基础上完成，3个因素分别为苦荞麦活性肽的添加量、苦荞茶的添加量、蜂蜜的添加量，进行L9（33）正交试验，根据感官评价标准进行感官评分，结果见表3。

从饮料配方L9（33）正交试验结果看出苦荞麦活性肽添加量、苦荞茶添加量、蜂蜜添加量对活性肽荞茶饮料的影响从大到小为苦荞麦活性肽添加量＞苦荞茶添加量＞蜂蜜。正交试验数据分析得A2B1C3配方是最佳，但实际上的出口味最佳的是第5组配方A2B2C3，分析结果与实际不符合，需要再验证。分别按照A2B1C3和A2B2C3配方调配饮料，试验结果表明A2B2C3配方在颜色、气味、口感、液体状态上比A2B1C3配方感官评价高。因此可以得出活性肽荞茶饮料最佳配方为A2B2C3，即苦荞麦活性肽添加量为1.5%、苦荞茶添加量为5%、蜂蜜添加量为5%。

表3 饮料配方L9（33）正交试验表Table 3 L9（33）Orthogonal test table for beverage formulation

2.3 灭菌条件的筛选

苦荞麦活性肽添加量1.5%、苦荞茶添加量5%、蜂蜜添加量5%，灭菌条件设计5个梯度为75℃20 min、85℃20 min、95℃20 min、105℃20 min、115℃20 min，编号为1-5组，每组两份。根据感官评价标准进行综合评分及菌落检测见表4。

表4 灭菌条件的感官评分图Table 4 Sensory scoring tables for sterilization conditions

结果显示，灭菌条件为75℃20 min时颜色淡黄色清亮、气味、口感和液体状态均良好，但微生物检测时出现菌落，视为不合格。当灭菌条件高于75℃20 min时未检测出菌落，但灭菌条件为115℃20 min时颜色深褐色且口感变苦且还有少许沉淀，可知高温对饮料的口感及颜色有影响。与其他条件相比，灭菌条件为105℃20 min时活性肽荞茶饮料的颜色、气味、口感、液体状态最佳，因此灭菌条件选为105℃20 min。

2.4 活性肽荞茶饮料微生物检测结果与分析

活性肽荞茶饮料经105℃20 min灭菌后分别放置7、14、21、28 d，再进行微生物检测。通过观察检测出菌落，观察结果见表5。

表5 饮料微生物检测指标结果Table 5 Results of microbiological testing indicators for beverages

饮料灭菌室温放置28 d后经微生物检测并没有发现平板上出现菌落，可知饮料的灭菌条件为105℃20 min时不仅口感良好而且未检测出菌落。初步判断活性肽荞茶饮料是安全且保质期较长。如果活性肽荞茶饮料得以上市，则需要用更精确的微生物检测方法对饮料中微生物进行检测。

2.5 活性肽荞茶饮料的抗氧化性检测结果与分析

通过正交试验结果调配的活性肽荞茶饮料，灭菌后进行抗氧化活性检测。采用DPPH自由基清除法通过分光光度计测定工作液吸光度值为0.723，饮品DPPH样液吸光度值为0.250。计算得出饮品DPPH自由基清除率达到65.42%。

3 结论与讨论

通过单因素及正交试验可知苦荞麦活性肽、苦荞茶、蜂蜜对活性肽荞茶饮料的影响从大到小为苦荞麦活性肽添加量＞苦荞茶添加量＞蜂蜜，将这三因素按比例混合后饮料的颜色、气味、口感、液体状态得到很好的综合，根据感官评价标准进行评分后得活性肽荞茶饮料的最佳配方，即苦荞麦活性肽添加量为1.5%、苦荞茶添加量为5%、蜂蜜的添加量为5%，且灭菌条件为105℃20 min。

在食品安全方面，采用平板计数方法检测饮料，初步检测尚未出现菌落。若活性肽荞茶饮料可以上市，对饮料微生物检测的要求更严格，需将饮料送到食品微生物检测机构进行检测。

苦荞麦活性肽有较强抗氧化功能，对饮料样品进行抗氧化性检测时，利用分光光度计检测出自由基清除率达65.42%，在功能性饮料中抗氧化性可以说是比较高的。因此可以将活性肽荞茶饮料作为一种功能性饮料进行开发。该功能性饮料现处于试验阶段，若要作为产品推向市场，还需要进行动物实验，对饮料进行安全性及功能性的进一步检测。

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