急性缺血性卒中患者血清胱抑素表达水平及结构形式的临床研究

马金花，马斌武，梁雪云

胱抑素C(Cys C)参与多种神经系统疾病的病理生理过程，其损伤对神经细胞凋亡的影响及其机制还不是很清楚。本文研究急性脑缺血后患者血清Cys C表达水平是否会升高，升高是否以寡聚体升高为主，是否与急性脑缺血的严重程度有关，为下一步在细胞层面研究不同结构形式 Cys C(单体和寡聚体)对缺氧状态下神经细胞的增殖及凋亡的影响及其机制提供一定的理论依据，也为进一步研究急性脑缺血后血清Cys C寡聚体表达水平升高与血管性痴呆的发生、发展的关系提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2016年5-8月在我院脑卒中单元及神经内科住院治疗的急性脑缺血患者32例(急性脑缺血组)，所有病例均符合纳入及排除标准。选择同期在我院健康体检中心体检的健康人群26例作为对照组，均符合排除标准。2组患者一般临床资料对比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。急性脑缺血的诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》2010版制定的标准[1]；入组患者发病在14 d以内且临床首次考虑急性脑梗死者。排除患有影响血清Cys C表达水平疾病者,合并有心、肝、肺及肾功能不全者,既往有脑血管病史者。

表1 2组患者相关临床资料的比较

1.2 研究方法

1.2.1 入院评估：采用美国国立研究院卒中评分量表对入组急性脑缺血患者进行NIHSS评分[2]，并根据评分结果进行如下分组：轻度，评分0～9分；中度，评分10～19分；重度，评分20分以上者。

1.2.2 血清 Cys C检测：用ELISA蛋白检测法检测，试剂盒由武汉博士德生物科技公司提供。入组研究对象要求禁食8 h或以上，次日早晨采集空腹静脉血10 mL，离心分离血清，待检。血清Cys C浓度0.51～1.03 mg/L为正常水平。

1.2.3 血清Cys C结构形式的检测：用免疫沉淀-Western blotting 蛋白检测法，先将免疫沉淀所得样品100 ℃煮沸变性，行SDS-PAGE 电泳凝胶电泳，湿法转膜将凝胶中蛋白条带转移至PVDF膜上，利用双色红外荧光成像系统(Odyssey)采集分析图像，按不同分子量分析 Cys C 结构形式：单体13 kD，寡聚体13n kD(n为≥2的整数)。

2 结果

2.1 2组患者Cys C表达水平比较：急性脑缺血组患者Cys C浓度为(1.086±0.658)mg/L，高于对照组的(0.687±0.099)mg/L，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 2组患者血清中Cys C寡聚体率比较： 将免疫沉淀后血清样本进行Westen blotting检测，结果显示87.5%的急性脑缺血患者血清样本中Cys C 呈寡聚体形式，而对照组血清样本只有19.2%的寡聚体化，大多数仍表现为单体，见表2。

表2 2组患者Cys C寡聚体的比较[n(%)]

注：*与对照组比较，χ2=27.26,P<0.05。

2.3 急性脑缺血不同程度组Cys C表达水平比较：32例患者中轻度组26例，中度组6例。采用Wilcoxon秩和检验比较不同程度分组患者的Cys C值，结果显示差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同程度患者Cycs C比较

3 讨论

Cys C属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，是一种小分子碱性蛋白，广泛存在于各种体液中，但以脑脊液水平最高。近期研究显示，Cys C最重要的生理功能是参与细胞内外蛋白质水解的调控,通过调节半胱氨酸蛋白酶及基质金酶的活性，而维持机体的正常代谢[3]。有研究发现，Cys C可以自由通过肾小球，其血清浓度不受体重等因素影响，是优于传统血清肌酐的评价肾小球率过滤的新指标[4]。陈正徐[5]等研究指出，Cys C可以被认为是糖尿病肾病 (DN)肾功能早期受损的标志物。Cys C与组织蛋白酶相互作用共同参与机体的多种病理生理过程，包括炎症的发生与发展、抗原呈递、肿瘤转移、病原体入侵以及心脑血管疾病等[6]。Kiyosue 等[7]研究提示，Cys C可作为评估冠状动脉疾病患者病情严重程度的有用指标。国内外一些研究指出，Cys C可能与脑血管疾病的发生、发展，以及血管性痴呆的发生、发展有关。

关于血清Cys C浓度与急性脑缺血之间的关系，目前尚缺乏统一定论，主要存在的观点包括以下两方面：①大部分研究表明血清Cys C水平升高，与急性脑梗死发病之间存在了诱导性关系，Cys C 很大程度上属于急性脑梗死发生、发展的危险性因素[8]。另外有学者认为Cys C表达水平和亚临床型脑梗死发病之间存在着密切关联，它属于亚临床型脑梗死的一项尤为重要的危险性参考标准[9]。姚恩生[10]等研究结果表明，Cys C 水平在脑梗死急性期是明显增高的，且存在意识障碍、大面积脑梗死者Cys C 水平明显高于小面积脑梗死及无意识障碍者，血清Cys C 水平升高可能影响急性脑梗死病情严重程度及预后。郭方圆[11]及张填[12]等都指出，Cys C 水平升高是急性脑梗死的一个危险指标，且该物质与急性脑梗死的发生、病情轻重、近期预后等均密切相关。②还有少部分研究认为，血清Cys C属于急性脑梗死发病的一种保护机制，赵德强等[13]经对83例脑缺血患者全血Cys C水平的分析，发现急性脑缺血组患者Cys C水平较对照组低，考虑此种保护作用与半胱氨酸上的巯基之间有密切关联。本研究结果表明，急性脑缺血患者血清中 Cys C表达水平较对照组升高，这与以往国内外大多数研究结果相吻合。Cys C在急性脑缺血组血清中表达升高的机制，我们推测可能如下：①Cys C作为内源性组织蛋白酶抑制剂，在发挥作用过程中可能影响血管壁的重构，因此参与到血管硬化过程中，然而多数急性脑缺血患者血管存在不同程度的动脉硬化[14]。②在缺血急性期，脑脊液中Cys C可能破坏血脑屏障进入血循环，表现为血清Cys C表达水平增高。③急性脑缺血病程早期可能存在脑组织水肿，造成颅内压升高，应激性肾素-血管紧张素系统激活，神经-内分泌功能紊乱，肾小球率过滤下降，导致经肾脏排出Cys C减少，表现为血清中Cys C表达增高。对于Cys C表达水平与急性脑缺血严重程度之间的关系，本研究与既往很多研结果存在分歧。本文通过对不同NIHSS评分结果急性脑缺血患者之间的比较，提示血清Cys C的表达水平与急性脑缺血患者NIHSS评分无明显关系，考虑可能有如下影响因素：①Cys C表达受多种未知因素的影响，临床中我们未能将不同程度急性脑缺血的影响因素做到统一；②本研究随机收集病例，并根据入院当天NIHSS评分将病例进行分组，造成各组比例数差距较大，这种不可控因素可能对研究结果造成影响，对研究结果造成偏差。后期为进一步得到更为可靠的结果，将会扩大样本量或统一各个等级NIHSS评分的病例数进行研究。

Cys C作为组织蛋白酶抑制剂而发挥作用，同时其自身易受某些病理因素的影响，本身的活性也会被Cathepsin D或者弹性蛋白抑制而发生突变。早些年有研究[15]报道，在高温、低pH或变性剂存在情况下，重组Cys C易被诱导转变为二聚体形式。吴志新曾在Cys C的脑保护作用及其临床应用研究进展一文中指出，Cys C基因突变形成的Cys C蛋白容易形成稳定的二聚体，其二聚体又以淀粉样纤维素形式沉积在血管壁上，从而形成脑淀粉样血管病，众所周知淀粉样物质在脑组织内沉积则会增加老年人罹患AD或VD的风险[16]。Xu[17]等研究也表明，突变型Cys C可以形成淀粉样蛋白沉积于血管壁而影响血管健康，与脑血管淀粉样病和AD有关。Levy等[18]报告，在一些脑血管疾病患者大脑中发现有寡聚化或者多聚化的Cys C存在。本研究初步猜想，这种寡聚体形式的Cys C会不会与急性脑缺血有某种关系将进一步实验证实，急性脑缺血患者血清Cys C增高是以寡聚体形式为主，这与既往研究结果相符。结合以往多项研究，我们推测Cys C寡聚体可能会影响或者加剧急性脑缺血患者认知功能的改变，最终导致VD的发生并影响其发展。也有研究指出，血清Cys C 浓度的高低可能与患者认知功能的好坏呈反比关系[19]。对于Cys C 如何影响急性脑缺血患者认知功能，有研究推测，可能与细胞增殖凋亡、氧化应激反应、 β样淀粉蛋白的分泌增加、淀粉样血管病变、神经元的再生及变性等相关[20]。下一步将研究在细胞层面研究不同结构形式 Cys C(单体和寡聚体)对缺氧状态下神经细胞的增殖及凋亡的影响及其机制，急性脑缺血后血清寡聚体Cys C表达水平升高与血管性痴呆的发生、发展的关系。

综上所述，急性脑缺血患者血清Cys C水平升高，且以寡聚体升高为主，血清Cys C水平与急性脑缺血严重程度无明显关系。本研究的完成，将为下一步在细胞层面研究不同结构形式Cys C(单体和寡聚体)对缺氧状态下神经细胞的增殖及凋亡的影响及其机制提供理论依据。因受样本量限制，本研究结果可能存在片面性，在后期的研究中可以考虑扩大样本量，对临床中急性脑缺血患者血清Cys C表达水平进行随访性监测，以期寻找血清Cys C的表达水平的界值，为预测和防治VD提供理论依据。

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