基于90K芯片标记的小麦芒长QTL定位

张传量，简俊涛，冯洁，崔紫霞，许小宛，孙道杰

（1西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100；2南阳市农业科学院，河南南阳 473000）

0 引言

【研究意义】小麦的芒作为变态叶，具有一定的光合作用，是植物进化和适应自然环境的结果，也可以作为区分不同小麦品种和基因定位的重要形态标记[1]。在小麦灌浆后期，当旗叶已经开始衰老且其光合能力下降时，芒仍能保持较高的光合速率，其光合产物成为小麦籽粒同化物来源的重要补充[2-5]。芒的表层加厚、厚壁组织和疏导组织发达具有明显的抗旱性结构特征[2]。芒具有表皮坚硬倒钩状硅质毛，不利于害虫的飞落, 降低害虫在麦穗上产卵的机会, 具有一定的抗虫性。小麦芒对增产也具有重要意义，有芒的小麦品种通常可比无芒品种增产10%以上[6-7]。因此，对芒长性状进行定位分析，获取与性状紧密连锁或共分离的分子标记，可为分子育种提供依据。【前人研究进展】研究表明，芒性状属于数量性状，有4个主要的抑制基因（B1、B2、B3、Hd）和1个促芒基因A以及部分微效基因共同决定芒的发育，芒的抑制作用B1＞B2＞B3＞Hd，Hd是引起勾芒产生的原因[5,8]。B1被定位在5AL的末端，与分子标记Xgwm291紧密连锁[5,9]；LI等[10]利用硬粒小麦的双端体材料将B2定位于 6BL-5和 6BL-6缺失片段末端之间，与分子标记Xwmc539、Xgpw5130和Xwmc748邻近；SOURDILLE等[8]把Hd定位在4AS的Xfba78标记附近。近期，宫希等[11]研究发现，抑芒基因B1与5AL上的分子标记wpt-1038 紧密连锁，勾芒基因Hd与4AS上的标记Xgpw4448紧密连锁，且2个基因对芒长的抑制作用具有累加效应。SNP标记的密度远远高于传统分子标记的密度，对于数量性状的QTL定位更为高效、便捷[12-14]。另一方面，目前QTL定位多以双亲的衍生群体为材料来进行，此种方法难以将双亲中无多态性的关键基因位点检测出来[15-16]；相比之下巢式关联作图群体（NAM）包含更多的亲本，基因位点的多态性更为丰富，因而具有更大的QTL检测功效，其结果更为可靠[16-18]。【本研究切入点】然而，目前尚未见到小麦芒性相关基因紧密连锁的SNP标记。【拟解决的关键问题】利用90K标记构建高密度连锁图谱和包含1个共同亲本的2个RIL群体对其芒长QTL进行定位分析，挖掘控制芒性状能够在多环境下检测到的主效QTL，为相关基因克隆和分子育种打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料以及田间种植

用3个优良品种（系）小偃81、周8425B和西农1376（简称XY81、Z8425B和XN1376）构建了小偃81/周 8425B（简称 XZ）、小偃 81/西农 1376（简称XX）的2个组合的F9∶10代RIL群体，分别由102个和120个家系构成。3个亲本中，小偃81属于短芒材料，8425B和西农1376属于中长芒材料。将3个亲本及2个RIL群体于2016年10月至2017年6月在陕西杨凌（简称YL）、河南南阳（简称NY）和河南驻马店（简称ZMD）三地分别种植。完全随机区组设计，设2次重复，每株系种植2行，行长为2.0 m，行间距为0.25 m，株距6.7 cm，单粒播种。田间管理按照常规标准进行，生长期间无病虫害暴发。

1.2 分子标记的检测

90K标记利用Illumina SNP Genotyping技术测试平台（北京博奥生物有限公司），使用微珠芯片技术（Bead Array）进行检测，利用Genomestudio v1.0软件进行多态性分析。

1.3 表型性状的测定及数据处理

小麦蜡熟期每个株系选4株，每株随机取3穗，每穗随机取2个侧芒，用游标卡尺测量长度，取平均值用于表型及遗传力分析。

利用IciMapping的ANOVA功能进行田间数据分析及遗传力的估算。用基于完备区间作图模型IciMapping[19]的BIP功能对陕西杨凌、河南南阳和河南驻马店试验点 3种环境下芒长的表型值分别进行QTL定位，并利用此软件的MET功能进行3种环境的联合分析以及 QTL与环境互作分析[17,20-21]。在a=0.05显著水平下进行1 000次排列检验，确定芒长性状QTL的LOD阀值，采用正向-反向逐步回归法控制背景，步长设为1 cM。并依据STUBER等[22]提出的判别标准确定QTL作用方式。QTL的命名方法为群体大写缩写，加Q加性状缩写，加QTL所在的染色体，同一染色体上多个QTL用-1、-2、-3……来表示。例如Qal5A-1代表5A染色体上检测出来的第一个控制芒长的QTL。将在联合分析和单环境下都能够检测到，且单环境下表型贡献率＞10%的QTL定义为“主效QTL”；将在3个环境中都检测到的QTL定义为“环境钝感QTL”[23]。

2 结果

2.1 表型数据分析

从表 1和图 1可以看出，2个群体的共同亲本XY81与另外2个亲本Z8425B、XN1376在芒的长度上存在较大差异。不同株系的目标性状差异大且2个群体的偏度绝对值＜1，峰度绝对值＞1，符合QTL作图条件，可用于QTL定位研究[24]。2个群体均出现了不同程度的超亲分离现象，且群体的遗传力较大，可以初步判断至少存在一个效应较强的控制位点。

图1 周8425B、西农1376和小偃81的穗芒形态Fig. 1 Awn feature of Z8425B, XN1376 and XY81

2.2 遗传图谱的构建

利用90K基因芯片81 587个标记对ZX和XX群体基因型进行多态性分析。小偃81和周8425B组配的 XZ群体中亲本之间共筛选出 11 037个多态性标记，利用IciMapping的bin功能对其进行冗余标记的删除，最终1 663个标记被连锁到图谱上，基因组全长为4 412.14 cM，平均图距2.65 cM，覆盖了小麦21条染色体组。分布于小麦A、B和D染色体组的标记数分别为735、790和138个，连锁长度分别为2 059.51、1 908.44和444.19 cM，平均图距最长的是2D染色体3.99 cM，平均图距最短的是4D染色体0.99 cM。小偃81和西农1376组配的XX群体中亲本之间共筛选出9 728个多态性标记，删除冗余后1 855个标记被连锁到图谱上，基因组全长为4 281.67 cM，平均图距2.31 cM，覆盖小麦21条染色体组。分布于小麦A、B和D染色体组的标记数分别为761、939和155个，连锁长度分别为1 836.14、1 961.39和484.14 cM，平均图距分别为2.41、2.09和3.12 cM。其中连锁图谱中 5B染色体标记数目最多 180个，4D染色体标记数目最少4个；5A染色体图距最长337.92 cM，2D染色体图距最短23.52 cM。平均图距最长的是3D染色体4.25 cM，平均图距最短的是3B染色体1.78 cM。

表1 亲本及RIL家系的芒长表型统计分析Table 1 Statistic analysis of parent and RIL family for plant awn length

2个图谱的比较分析可以看出（附表1），90K的连锁标记数在小麦基因组A、B和D间分布不均衡，但均表现为B基因组的标记数＞A基因组的标记数＞D基因组的标记数。就2个连锁群之间公共标记而言，其中A染色体组公共标记最多，D染色体组公共标记最少。对于单条染色来说，3B染色体上公共标记最多86个；1B、2D、3D和4D染色体上没有共同标记。各个染色体上的标记数分布详情见附表1。

2.3 芒长QTL定位结果分析

2.3.1 芒长QTL定位 2个群体共检测到6个控制芒长的QTL，位于5A、1B、3B、6B和2D染色体上（表2）。其中1个主效的QTL位点Qal5A-1，在2个群体3种环境下都能被检测到，属于环境钝感QTL，加性效应来源于父本小偃81，对芒长具有非常强的抑制作用，此位点被定位在 5A染色体的末端，且在置信区间内有一个共同的分子标记RAC875_c8121_1147，ZX群体定位的Qal5A-1与分子标记 RAC875_c8121_1147的遗传距离仅为1.28 cM，表型变异的贡献率为78.52%，可降低芒长效应值2.2 cm。XX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_ c8121_1147的遗传距离仅为0.13 cM，表型变异的贡献率为48.99%，可降低芒长效应值1.8 cm，详情见表2和图2。1个微效的QTL位点Qal6B-1（MET）加性效应来源于母本周8425B，表型变异的贡献率为1.39%，单个QTL可以增加芒长效应值 0.27 cm；4个微效的 QTL位点Qal1B-1（MET）、Qal3B-1（MET）、Qal2D-1（ZMD）和Qal2D-2（NY和MET）加性效应来源于母本周西农1376，分别可解释表型变异的3.66%、3.93%、5.53%和3.51%，可增加芒长效应值0.45—0.72 cm。XZ群体检测的2个QTL位点，其中1个主效位点Qal5A-1，1个微效QTL位点Qal6B-1，2个QTL表型变异的贡献率总和为 79.91%，略小于该群体芒长的遗传力87.03%。XX群体检测出5个QTL位点，1个主效位点Qal5A-1和 4个微效位点Qal1B-1、Qal3B-1、Qal2D-1、Qal2D-2，5个 QTL位点表型变异的贡献率总和为63.96%，小于该群体芒长的遗传力85.19%。2.3.2 芒长QTL与环境互作分析 从表2的第2、3列来看，单个环境检测出来的QTL，除环境ZMD中Qal2D-1外，其余的都能在联合分析中被鉴定出来，有3个（即Qal6B-1、Qal1B-1和Qal3B-1）未在单环境中检测出。此外，由于随机误差的存在，同一个QTL在单环境的位置估计也不尽相同，XX群体的Qal5A-1位点利用杨凌的表型数据被定位在 5A染色体的 75 cM处，置信区间为73.2—76.2 cM，其他3种情况（NY、ZMD和MET）被定位在5A染色体的74 cM处，置

信区间为73.7—76.2 cM，联合分析利用了更多的表型数据，得到的74 cM可能更接近于真实的位置。从表3的加性遗传效应来看，联合分析得到的6个QTL，加性遗传效应值的大小近似相同，说明这些QTL在3个环境间有着稳定的遗传效应。从表3的最后3列给出的加性与环境的互作效应来看，互作效应都远低于平均加性效应，说明QTL与环境间的互作不是影响芒长性状的主要因素。

图2 两个群体不同环境下小麦芒长的QTL分布Fig. 2 QTL distribution of wheat awn length detected in two populations in different environments

表2 不同环境下定位到影响小麦芒长的QTLTable 2 Location of QTL affecting wheat awn length in different environments

表3 QTL与环境互作分析检测到芒性状QTL的位置和遗传效应Table 3 Analysis of interaction between QTL and environment detected the awn character QTL location and genetic effect

3 讨论

3.1 连锁图谱对QTL定位的影响

本研究从XZ和XX 2个RIL群体中得到的连锁图谱，分别含有1 663和1 885个多态性SNP标记，标记间的平均图距分别为2.65和2.31 cM。同传统的RFLP、SSR标记构建的连锁图谱相比，本研究中用90K标记所构建的标记数目远高于其他研究。通过增加标记数目，提高连锁图谱的标记密度，缩小平均图距，增加了QTL检测精度，使在其他标记图谱的大间隔区段检测QTL成为可能。2个连锁图谱存在的共同问题是染色体组间标记数目分布不均衡，可能有以下2种原因，一是由于小麦基因组非常庞大且具有80%以上 DNA重复序列[25-26]，构建图谱误差较大，存在大量间隙；二是因为小麦的进化过程中，并没有形成含有D染色体组的四倍体小麦，减少D染色体组之间的基因交流，致使D染色体组相对其他染色体组具有较高的保守性[26-28]。

3.2 群体类型对芒长QTL定位影响

QTL定位过程中，所构建的定位群体的类型及大小对定位的结果及QTL的作用方式都有较大的影响。目前用于 QTL定位研究的群体主要有DH群体、F2群体、BC群体、RIL群体等。RIL群体通过多代自交，染色体间的重组概率显著提高，连锁基因的交换更为充分，染色体上相邻的不同QTL位点更容易分解开，有利于基因型与环境互作和 QTL定位分析研究[23]。BUCKLER等[17]用25个自交系与B73构建了巢式关联作图群体（NAM），进行开花期QTL分析，认为NAM 群体比单个的作图群体有更大的检测 QTL功效，检测结果更可靠。受研究规模制约，本研究使用1个共同的父本小偃81与另外2个不同来源的母本周8425B和西农1376构建RIL群体用于芒长QTL检测。在2个群体共同检测到的1个主效的QTL，即Qal5A-1在不同的环境下都能被识别出，属于环境钝感QTL，具有非常高的遗传稳定性。遗憾的是Qal5A-1对于不同群体的表型变异的贡献率不同，可能是因为2个群体的遗传背景不同导致的。另外这一主效位点被定位在 5A染色体长臂上的末端，对芒长具有非常强的抑制作用，该位点的效应极有可能源于强抑芒基因B1。与前人的定位结果相比较，ZX群体定位的Qal5A-1与分子标记 RAC875_c8121_1147的遗传距离仅为1.28 cM，XX群体定位的Qal5A-1与分子标记RAC875_c8121_1147的遗传距离仅为0.13 cM，远远高于杜斌等定位的精确度[5,9,11]。LI等[10]把抑芒基因B2定位在6B染色体上，本研究的Qal6B-1位点对芒长的效应值具有促进作用，两位点不属于同一位点。另外5个微效的QTL位点，即Qal6B-1、Qal1B-1、Qal3B-1、Qal2D-1和Qal2D-2，它们的表型变异的贡献率分别为1.39%、3.66%、3.93%、5.53%和3.51%，推测可能是新的QTL位点。2个群体的家系都出现了不同程度的超亲分离，对于极短芒或无芒家系形成原因，可能为基因互作引起的，导致极短芒或无芒家系形成。

4 结论

2个群体检测到1个主效位点Qal5A-1，此位点被定位在 5A染色体末端，与分子标记 RAC875_c8121_1147紧密连锁，对芒长具有强烈的抑制作用，表型变异的解释率高，遗传稳定性强，属于环境钝感QTL，可以针对芒长性状构建近等基因系和精细定位。

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