巨噬细胞自噬与动脉粥样硬化的关系及相关中药研究进展

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动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以动脉血管壁炎症改变为主的慢性、增生性疾病，其发生发展过程多认为是从变质、渗出和增生等炎症反应，到粥样斑块的形成，乃至不稳定斑块的破裂和继发血栓形成。AS是心脑血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)发生发展的重要病理基础，CVD是一类严重危害人类健康和生命的重大疾病，在世界范围内，每年约1 670万人死于CVD，占全球死亡率第1位[1]，尤其以AS为病理基础的CVD成为世界主要的疾病负担，防治AS已成为世界公共卫生关注的热点。医学界对AS的研究已逾百年，其病因及发病机制复杂，除脂代谢异常与动脉内脂质累积等经典因素外，免疫炎症反应也是影响AS发展的重要原因[2]。巨噬细胞作为斑块中炎症因子的主要来源和免疫应答中的主要免疫细胞，在AS斑块的进程中起重要作用。

有研究表明，AS斑块的形成和稳定性与巨噬细胞自体吞噬(自噬)密切相关。自噬在遗传进化中是由溶酶体介导的高保守代谢过程，通过降解毒性物质及回收利用内源性细胞成分(氨基酸、游离脂肪酸、核苷酸)以维持细胞稳态。自噬是影响巨噬细胞在AS生存的分子细胞机制，直接影响AS的发生和发展进程[3]，深入研究巨噬细胞自噬与AS关系，为中药防治AS提供新途径和新依据，从而充分发挥中药治疗AS的多靶点、多效应、不良反应少的独特优势。

1 自噬及其调控机制

自噬是普遍存在于真核细胞的一种自我保护现象，包括巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone- mediated autophagy)，巨自噬主要以降解生物大分子及损伤、衰老的细胞器，即通常所说的自噬，是导致Ⅱ型细胞死亡(即自体吞噬样细胞死亡)的唯一途径[4- 5]。自噬由脂质双层膜结构的吞噬泡包裹降解的物质形成自噬体，之后与溶酶体融合，转变为单层膜结构的自噬溶酶体。溶酶体的酸性环境及大量水解酶使物质变性水解，进一步降解为氨基酸、脂肪酸、糖类及核苷酸等，供细胞再利用，残渣排出细胞[6]。

自噬过程的调控及自噬体的形成主要依赖于自噬相关基因(autophagy- associated gene，ATG)，30多种ATG编码的特殊蛋白参与吞噬泡的成熟、延伸及自噬体与溶酶体的融合，包括Beclin1、ATG16L- ATG5- ATG12复合物及微管相关蛋白1轻链3(LC3- Ⅱ)- 磷脂酰乙醇胺(PE)复合物等[7]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule- associated protein 1 light chain 3，LC3)由哺乳动物细胞ATG8同源染色体编码，被ATG4活化后迅速将其切割形成LC3- Ⅰ。LC3- Ⅰ在ATG7和ATG16L- ATG5- ATG12作用下，进而与PE共价结合形式LC3- Ⅱ[8- 9]。LC3- Ⅱ可靶向定位于前自噬体和自噬体膜上，自噬时其表达增加，是目前公认的自噬体标志分子[10]，常用LC3- Ⅱ评估自噬水平的高低。自噬体膜的延伸依赖泛素样蛋白质系统的协同作用。

自噬受多种信号通路调控，其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyli- nositol 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)信号通路在自噬中发挥核心和关键的调节作用[8，11- 12]。PI3K分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，目前研究较广泛的是被细胞表面受体活化的Ⅰ型PI3K。Ⅰ型PI3K是上游关键分子，负调节自噬，它能连接到细胞膜上进而激活Akt；也可定位于内质网膜，干扰自噬体膜形成[13]。Ⅲ型PI3K激活时启动自噬进程，对自噬的调节作用较Ⅰ型更重要，Ⅲ型PI3K与下游信号分子Beclin- 1结合形成激酶复合物，引发自噬相关蛋白在两大泛素系统的聚积，从而促进自噬。由此可见，Ⅲ型PI3K 的活化对于早期阶段自噬囊泡的形成更重要[14]。mTOR能调节细胞生长、增殖、运动、存活等，是自噬相关信号通路核心，mTOR激活可抑制自噬。细胞因子(如胰岛素、胰高血糖素、瘦素)或应激(如HBx)等通过PI3K/Akt/mTOR信号通路，参与调解自噬[15- 17]。活化的Akt可解除下游结节硬化复合物(tuberous sclerosis complex，TSC1/TSC2)对mTOR的抑制作用，增加mTOR活性[18]。Akt活化减少，使细胞周期停滞，从而抑制细胞增殖，诱导细胞自噬。研究PI3K/Akt/mTOR信号通路对AS巨噬细胞自噬过程影响的干预实验中，给予AS家兔模型Akt抑制剂比鲁卡胺、mTOR抑制剂西罗莫司及mTOR- siRNA干预后，PI3K/Akt/mTOR作用通路被阻断，导致巨噬细胞自噬被激活，巨噬细胞白细胞介素(IL)- 10水平显著降低，干扰素- γ(IFN- γ)分泌增加，表明炎症反应降低，从而稳定AS斑块，减少斑块破裂[12]。

2 AS中细胞自噬的双重作用

自噬主要功能可看作是“清洗”不需要的大分子物质，是细胞内重要的降解体系及自我修复过程，有助于维持细胞稳态。大量证据表明，人类斑块样本的所有细胞均检测到自噬水平的增高，且存在血管自噬样特性：髓鞘样结构、细胞质泛素化包涵体聚积及空泡形成增多[19]。在AS斑块溶解产物及主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)纤维帽中，LC3- Ⅱ含量表达增加，在非AS血管中未检测到LC3- Ⅱ，表明在AS中自噬被诱导[8]。目前研究表明其作用具有双重性，病变早期，自噬作为潜在的补偿机制，维持体内平衡；病变后期，自噬作为细胞持续应激或无法防御的致病过程的适应性反应，失调或过度激活直接影响细胞的存活[20- 21]。

2.1 适度细胞自噬抑制AS发展 自噬通过阻断氧化应激诱发炎症过程抑制斑块进展，敲除自噬基因Beclin- 1和ATG5后，斑块中的炎性标志物明显增加，表明自噬功能缺失(主要是巨噬细胞)与炎症之间存在密切关系[22]。有研究认为，自噬功能缺失时细胞凋亡增加(主要是巨噬细胞)，同时巨噬细胞对凋亡细胞的识别能力下降，无法正常清除死细胞，使得斑块坏死增多，引发急性冠脉综合征[3]。因此，自噬相关基因缺失引起细胞对凋亡和坏死的敏感性。体内外实验研究表明，选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，可诱导巨噬细胞自噬，抑制炎性反应，继而稳定AS易损斑块[14]。自噬可降低巨噬细胞内胆固醇和胆固醇酯水平，敲除自噬基因后胆固醇酯明显增多，同时泡沫细胞形成增加。自噬除可抗斑块细胞凋亡外，还降低循环中含载脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)的脂蛋白含量，从而减轻脂质对AS斑块的进一步损害。这些研究从不同方面证实基础水平自噬对AS是有益的，有利于阻碍或减缓AS斑块形成和维持斑块的稳定性。

2.2 过度细胞自噬影响斑块的稳定性 基础水平的自噬可抑制AS发展，但过度自噬常引起细胞死亡，而VSMC和血管内皮细胞(VEC)死亡不利于斑块的稳定性。VSMC减少表明胶原合成减少和斑块纤维帽的变薄，VEC受损最终引起血栓的形成。De Meyer等[23]研究采用Toll样受体7(Toll- like receptor 7，TLR7)配体药物咪喹莫特干预AS模型兔子的颈动脉，诱导巨噬细胞自噬，但诱导自噬性细胞死亡同时引起大量炎症因子释放并刺激血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)的表达和白细胞的渗透。有研究表明，自噬引起的细胞死亡诱发许多细胞因子的释放，如IL- 1β、IL- 6及TNF- α，进而引起炎症反应[24]。严重的氧化应激和自噬形成蜡样体，蜡样体是一种蛋白质和氧化脂质结合形成的复合体，无法被溶酶体水解酶清除且能吸引大量溶酶体酶，使自噬体与溶酶体的结合受限，导致细胞死亡[25]。因此，细胞的自噬性死亡促进不稳定斑块的形成。

3 巨噬细胞自噬与AS

3.1 巨噬细胞分类及在AS中的作用 巨噬细胞是AS早期出现泡沫细胞的主要来源，且在免疫应答中发挥重要作用。单核细胞主要分化为两种类型：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。在AS硬化损伤部位，M1和M2两种亚型的巨噬细胞均存在，且具有极化性。M1巨噬细胞型具有促炎作用，在IFN- γ存在条件下被脂多糖(LPS)激活，导致IL- 2、IL- 23、IL- 6、IL- 1和TNF- α的表达量升高，加快AS进程。相反，活化的M2型巨噬细胞具有抗炎修复作用，在IL- 4、IL- 13、IL- 1或维生素D3存在条件下，释放大量IL- 10、清道夫受体(scavenger receptor，SR)、甘露糖受体和精氨酸酶[26- 27]，促进斑块纤维组织形成，减轻斑块组织损伤并增加斑块稳定性。Khallou- Lasehet等[28]采用小鼠模型解释巨噬细胞表型与AS之间的关系，模型中分别采用精氨酸酶1和精氨酸酶2分别标记M2和M1型巨噬细胞。早期病变中，浸润的巨噬细胞是M2型，但M1型巨噬细胞在大龄老鼠的粥样斑块中占优势，说明病变进展与M2型巨噬细胞和M1型巨噬细胞哪个占主导地位密切相关，早期病变中以促进炎症为特点，之后是抗炎[29]。氧化型低密度脂蛋白(ox- LDL)是导致AS的重要因素，通过多种途径参与AS的形成过程，是AS形成的始动因素[30]。当血管壁受到ox- LDL损伤时，产生趋化因子，单核细胞迁移于内膜下分化成巨噬细胞，通过受体特异性摄取ox- LDL，同时分泌炎症因子刺激更多单核细胞进入血管内膜导致巨噬细胞增殖，受体SR- A与ox- LDL结合后，使其无限制吞噬ox- LDL，当ox- LDL超过巨噬细胞的代谢能力时，导致巨噬细胞内脂质堆积，转化为泡沫细胞[31]。泡沫细胞清除率降低及泡沫细胞凋亡进一步激活炎症反应，SR上调形成恶性循环，促进血管内膜生长与坏死核的形成，增加斑块破裂的风险[32]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)在众多炎症与慢性疾病(如AS、冠心病、癌症等)的生理病理过程中起重要作用。在AS进程中，ROS蓄积引起氧化应激，直接导致蛋白质、脂类与DNA损伤，引发细胞死亡或凋亡，且巨噬细胞参与ROS中间产物、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的合成或分泌，加剧血管内膜的毒性环境。斑块内毒性环境的危险因素包括坏死与凋亡细胞的碎片、组织缺氧、ROS水平升高及脂质的积累[33- 34]。巨噬细胞自噬作为一种代偿机制，能减轻上述因素对斑块的不良影响。

3.2 巨噬细胞自噬对AS的影响 与AS密切相关的血管平滑肌细胞、内皮细胞及巨噬细胞存在一定程度的自噬。相对于前两者，巨噬细胞属于单核- 吞噬细胞系统，前体为从骨髓进入血液循环的单核细胞，从内皮渗出到组织并分化而成的免疫细胞。目前自噬在巨噬细胞中的抗AS作用研究较多。

自噬具有调节巨噬细胞极化功能的作用，可使促炎型M1型巨噬细胞向抑炎型M2型巨噬细胞转化。在易损斑块内，M1型巨噬细胞内核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF- κB)激活，促进分泌IL- 1β、IL- 6、活性氧中间物及含氮氧化物等促炎因子，继而引起强烈的细胞氧化应激及内质网途径依赖的细胞凋亡。在稳定斑块内，M2型巨噬细胞占多数，能有效吞噬细胞碎片及凋亡小体，减轻周围炎症反应。自噬通过分子伴侣蛋白P62识别泛素化NF- κB并转运至溶酶体进行降解，调节M1向M2转化。巨噬细胞自噬抑制后，可使M2细胞分泌类M1细胞的细胞因子。另一方面，激活骨髓来源的巨噬细胞自噬相关通路PI3K/mTOR后，M2细胞数量增多；反之，抑制PI3K/mTOR通路，M2细胞减少[35]。此研究表明，自噬通过促进巨噬细胞类型转换稳定易损斑块。

自噬促进巨噬细胞内胆固醇的流出，其主要机制是自噬调节胆固醇从巨噬细胞流出是通过溶酶体酸性脂肪酶(LAL)实现，巨噬细胞自噬将脂滴(LDS)运送到溶酶体，通过LAL在溶酶体中水解，最终可能依赖三磷酸腺苷结合转运蛋白A- 1(ABCA1)通路介导巨噬细胞泡沫细胞胆固醇流出。有研究结果表明，药物阻断或ATG5敲除的巨噬细胞中，均可见到胆固醇的流出障碍[36]。自噬在巨噬细胞胆固醇流出所发挥的积极作用，这种特殊的选择性自噬称为脂自噬(Lipophagy)[37]。此外，脂质负荷巨噬细胞中，自噬标记物明显增加[36]。

自噬可能通过减少炎性反应和炎症体形成起到抑制细胞凋亡的作用。ROS是自噬过程中的扳机[22]。当大量异常蛋白质在细胞内聚积时可对细胞产生毒性效应。细胞通过蛋白酶体及自噬溶酶体途径降解蛋白质，两者均通过泛素化信号识别蛋白。泛素样结合蛋P62/SQSTM1(sequestosome- 1，SQSTM1)可结合泛素化的蛋白质与LC3相互作用后将泛素化蛋白转运至自噬溶酶体，同时自身被降解。在进展期斑块内，巨噬细胞P62水平显著提高，自噬功能受损。巨噬细胞自噬抑制后，AS斑块内损伤蛋白不能及时清除，从而激活炎症体及凋亡信号。另一方面，线粒体自噬缺陷导致细胞内ROS显著增加，ROS是激活炎症体的潜在因子，损伤线粒体破裂后引起细胞色素C释放，导致细胞凋亡。巨噬细胞自噬通过清除损毒性蛋白及降解脂质抑制炎症信号激活[35]，抑制细胞凋亡降低斑块破裂风险。目前有部分学者认为，巨噬细胞的自噬性死亡有利于防止AS发生发展，因此在斑块形成中巨噬细胞的自噬作用存在一些争议。

4 中药对自噬的干预在AS中的作用

中药是中医学的传统药物，通过多靶点、多途径、多环节共同参与发挥疗效。近几年来，随着对自噬研究的不断热化及相关检测方法的完善，有关中药对自噬影响的课题受到越来越多的关注，研究者们将自噬作为某些中药发挥作用的新靶点。Zhu等[38]体外研究显示，白藜芦醇通过诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)自噬而起到抗炎作用，分析其与通过激活cAMP- PRKA- AMPK- SIRT1信号通路有关。白晔等[39]研究显示，化痰消食方对过氧化氢刺激的内皮细胞自噬性死亡具有抑制作用，分析其与上调细胞内PKB表达、下调LC3表达有关。杨亭等[40]用青风藤的有效成分青藤碱体外干预人内皮细胞EA.hy926，其可通过细胞外调节ERK通路诱导细胞自噬起到抗炎作用。倪小鸥等[41]通过建立ApoE基因敲除小鼠AS不稳定斑块模型，观察搜风祛痰法中药复方稳斑汤对小鼠AS模型不稳定斑块自噬相关蛋白Beclin1和LC3的影响，结果显示复方稳斑汤可能通过影响Beclin1与LC3的蛋白表达，从而影响AS斑块的稳定性。在阐释中药诱导巨噬细胞自噬对AS保护作用的分子机制方面备受关注，He等[42]研究发现，葫芦素能增强LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞自体吞噬，从而发挥抗炎作用。刘明玥等[43]表明槲皮素能明显抑制ox- LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞内胆固醇的累积，从而起到促进胆固醇流出及抑制胆固醇流入的作用。槲皮素可降低高脂喂养小鼠肝脏脂质积累，降低与脂肪肝相关基因表达，调节肝脏脂质代谢相关基因表达，提高巨噬细胞胆固醇输出，保护低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡[44]。Liu等[45]证明在RAW264.7细胞中白藜芦醇通过激活Sirtl调节的自噬促进其对ox- LDL诱导的凋亡细胞胞葬作用，表明白藜芦醇可能在AS方面发挥保护作用及成为AS潜在的治疗措施。玄参、密蒙花等具有清热解毒功效的中药中含有一种天然的黄酮类化合物芹菜素。王群[46]通过体外实验发现芹菜素不仅能诱导巨噬细胞源性泡沫细胞发生caspase依赖的凋亡，还能诱导自噬小体的形成从而发生自噬，在结合自噬和凋亡通路调控AS的进展方面上提供新思路。

5 小 结

中医药是以整体观为指导，辨证论治，系统治疗，通过多途径、多靶点整合起效，且具有毒副作用小、起效平稳等西医西药不具备的优点，尤其对于复杂性疾病的治疗凸显独特的优势。自噬作为一种高度保守的代谢机制，维持真核生物细胞内环境稳态，诱导正常细胞自噬可能有以利于预防AS发生，而对已形成的粥样斑块动脉血管，诱导巨噬细胞自噬可能减少炎性反应、抗细胞凋亡、促进胆固醇外流等稳定易损斑块。因此，研究中药对巨噬细胞自噬的影响，具有极大的研究潜力和应用价值。中药治疗AS的自噬机制有许多问题尚待阐明，PI3K/AKT/mTOR作为自噬调控的经典通路，将有利于深入研究其在巨噬细胞自噬及AS发生发展中的作用，是自噬复方研究新的着力点，最终将其运用至临床以提高AS的防治效果。