外周血microRNA与肺癌

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(1.湖南师范大学附属张家界医院，湖南 张家界 427000；2.湖南师范大学附属第一医院；3.武汉大学中南医院)

1 MicroRNA概述

人类基因组包括20 805个编码基因和37 147个非编码基因及假基因，通过RNA加工与编辑可形成196 501个基因转录本，RNA在人类基因组中扮演着重要角色。其中微小RNA (microRNA)分子长度很短，通常存在于外周血中,被包裹于外核体、微粒和凋亡小体中，参与囊内运输，部分microRNA存在于脂蛋白等复合物中参与囊外运输。虽然血液中存在大量的核糖核酸酶，但是外周血中microRNA相当稳定，通过不同的极端条件(如高温、延长保存期、反复冻融等) 处理microRNA，发现其稳定性并没有明显改变，表明microRNA具有很强的抗RNase A水解能力，其稳定性有助于功能的发挥。

MicroRNA可同时调节多个基因或参与多条途径从而影响整个生物过程网络而发挥其独特功能。自从首次报道癌症中有microRNA异常表达以来，microRNA就被认为是肿瘤发病机制的关键调控因子，也是新型临床干预的标志物。随着我国工业化速度加快、环境污染逐渐加重、人口老龄化结构日趋明显，肺癌的发病率、病死率均呈上升态势，严重危害着人们的健康。然而,由于肺癌早期一般无明显症状,一旦确诊大部分已是中晚期，肺癌患者预后极差。因此,寻找早期诊断和早期治疗的方法和手段迫在眉睫。而通过生物分子方面的研究以寻找更有效的早期诊断方法，靶向治疗肺癌，是目前国内外的研究热点。近年来一些研究显示microRNA可用于肺癌的早期诊断及治疗[1]，提高肺癌患者生存率。 本文将总结概括microRNA在肺癌领域发挥的作用，以及它在临床应用中的潜力。

2 MicroRNA与肺癌的发生发展

目前肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，是机体在各种致瘤因子的作用下，局部组织细胞在基因水平上失去了正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物。研究表明microRNA与肺癌的发生、发展及转移密切相关[2]。MicroRNA通常位于染色体区域的“脆弱点”以及与肿瘤相关的基因区域，可通过调控相关靶基因的表达，影响细胞的增值、侵袭及转移等生物学行为，参与肿瘤发生发展的过程。

2.1 MicroRNA基因在肺癌中的致癌作用在肿瘤中呈高表达的microRNA基因被认为是癌基因，它们通过抑制抑癌基因的活性，促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡，从而促进肿瘤的发生发展。多顺反子miR-17～92簇是microRNA中具有原癌基因作用的代表，在多种类型的恶性肿瘤中高表达，包括肺癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤等。Takahashi团队首次发现了microRNA与肺癌的关系，他们的研究显示在肺癌细胞中，miR-17～92簇显著过度表达，促进肺癌细胞增殖生长。另外有研究显示miR-17～92可通过下调RAB14从而阻止肺部对外部致癌物的作用，从而导致肺癌的发生。miR-21基因是研究较多的另一种具有原癌基因作用的microRNA，下调miR-21 的表达可以抑制肺癌干细胞的增殖和侵袭能力[3]。MiR-21水平与磷酸化EGFR水平相关，并被EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)抑制，反义miR-21增强EGFR-TKI诱导的细胞凋亡，促进非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的细胞生长和侵袭。Jiang等[4]研究证实miR-21可阻止程序性细胞死亡4的表达而激活PI3K/AKT/mTOR 通道，促进NSCLC的生长。另外，Wang等[5]研究显示在NSCLC细胞系中重新导入miR-575，可显著促进细胞增殖，提高癌细胞迁移和侵袭的能力。另有研究结果表明miR-27a的过度表达可通过抑制原代人支气管上皮细胞的恶性转化的靶基因FBXW7来促进细胞生长。总之，microRNA中有多种基因可通过影响细胞增殖、生长及凋亡等过程，从而有助于癌症的发生与发展。

2.2 MicroRNA基因在肺癌中的抑癌作用microRNA家族中部分基因的抑癌作用也是其重要功能之一。其中let-7可以负调控细胞周期进程和终末细胞分化起抑制作用，与邻近的正常肺组织相比，在肺癌组织中，let-7家族表达明显下调，患者总生存期减少。近年的数据[6]显示let-7可联合miR-34协同抑制非小细胞肺癌细胞增殖来抑制肿瘤的发生与生长。另外，研究人员发现43%的NSCLC样本中miR-34b / c的表达显著降低，miR-34的恢复可抑制肺癌细胞的生长。而肺组织是miR-449优先表达的位点，与相应的正常组织相比，R-449a / b的异位表达降低了多种肺癌细胞系中的细胞活力而起肿瘤抑制作用，因此，miR-34/449家族在肺癌中起抑制肿瘤作用。miR-125b的表达可能通过抑制抗凋亡分子Mcl-1或Bcl-w诱导来源于肺癌的各种细胞系和致敏的癌细胞对不同凋亡刺激的自发性凋亡，表明miR-125b的上调可抑制肿瘤的发展。MiR-183家族成员(miR-183，miR-182和miR-96)具有共同和独特的靶标，所有这三个成员可抑制调节癌症中锌稳态的锌转运蛋白，从而抑制肺肿瘤的侵袭和转移，然而zhang等人[7]的研究显示miR-183可促进非小细胞肺癌的生长，但是其具体作用机制及家族其他成员的作用尚未完全明确。因此microRNA中抑癌基因的作用非常复杂，尚需进一步的实验来证实。

2.3 microRNA调节肺癌血管的形成随着肿瘤的增长，瘤体中心与原血管之间的距离变得越来越大，其中心易出现缺氧。缺氧是肿瘤发生的主要标志，它调节着缺氧诱导因子1(HIF-1)的活性，而HIF-1-α诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)等不同血管生长因子的表达，作用于各自的受体，促进新的毛细血管形成。艾丽菲热·买买提等[8]综述显示miR-126、miR-15a 、miR-16、miRNA-128、miR-20a、miR-20、miR-93、miR-15b等miRNA 通过直接或间接作用于VEGF及其信号通路而影响血管新生的进程。越来越多的证据也表明，microRNA是肺癌血管生成以及缺氧反应的重要调节因子。在NSCLC细胞中miR-126的表达直接导致VEGF-A下调，从而影响肿瘤中新生血管的形成，而miR-519c的过表达会导致HIF-1-α的显着降低和肺癌血管生成的减少。此外，在肺癌血管生成过程中还受成纤维细胞生长因子(FGF)和白细胞介素-8(IL-8)等细胞因子的作用，而这些细胞因子又受microRNA的调节。在NSCLC患者的肿瘤样本中，通过miR-200的调控，IL-8水平升高，而且miR-200可以靶向肿瘤的内皮细胞和生长调节蛋白细胞，影响肺癌血管的生长。相反，miR-378的过度表达增强了IL-8的表达，因此增加了NSCLC患者内皮细胞的刺激[9]，促进细胞生长。还有其他与血管生成有关的蛋白质也受到microRNA的调控，例如，异常表达的miR-381可在mRNA和蛋白质水平均可抑制干细胞基因ID1的表达，参与肿瘤侵袭和血管生成，并因此显著降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力。

此外，异常表达的microRNA亦与肺癌转移密切相关，最新的一项研究提示[10]miR-200家族和miR-183-96-182集群通过靶向作用于Foxf2抑制肺癌的侵袭与转移。因此，microRNA不但可以发挥癌基因和抑癌基因的直接作用，还能通过调节肺癌血管的生成、影响肺癌的转移而发挥作用。

3 MicroRNA在肺癌中的临床运用

microRNA与肺癌发生、发展的交织网络暗示microRNA参与肺癌发病机制的多个环节，靶向microRNA是干预肺癌的新方法，包括诊断、治疗和结果预测。

3.1 MicroRNA用于肺癌的早期诊断早期诊断是肺癌治疗的关键。癌胚抗原、糖类抗原、蛋白和酶类是肺癌诊断常用的肿瘤标志物，但其敏感性和特异性均不高，发现新的早期诊断标志物十分重要。近年来一项新的检测技术——液体活检问世，为肺癌的精准诊断带来了新希望。这项新技术主要通过检测体液中来源于肿瘤的循环肿瘤抗体谱、microRNA、循环肿瘤DNA和外泌体等生物标志物来反应与肺癌有关的情况，为肺癌的早期诊断提供一种无创、简洁、快速的手段。其中液体活检的主要项目就是外周血microRNA。外周血microRNA与肿瘤组织microRNA具有一定的相关性，多数异常表达的microRNA在组织和外周血中有相同的变化趋势[11]。外周血microRNA非常稳定，能够抵抗核糖核酸酶的降解，且在体内生存期长，经室温过夜、煮沸、反复冻融、过酸处理，仍十分稳定。因此，通过液体活检检测外周血中microRNA的表达将可能成为诊断肺癌的重要标志物，并且比传统的病理活检手段更具有优势。Vosa等[12]通过研究发现在肺癌组织中, miR-21, miR-210, miR-182, miR-31, miR-205, miR-183表达上调，miR-126-3p, miR-30a, miR-30d, miR-486-5p, miR-451a, miR-126-5p, miR-143, miR-145表达下调。 Cui等[13]研究发现，miR-125b表达水平的升高与肺癌患者的生存率降低有关。检测这些microRNA有助于肺癌的早期诊断。

目前检测microRNA的常用技术有实时荧光定量PCR、Northern blot法、原位杂交技术、基因芯片、电化学传感仪、Sanger 测序、基因敲除和过表达等，目前运用最多和最成熟的是PCR。Tang等[14]运用Q-PCR分析法，结果显示与健康对照组相比，在血浆中miR-21和miR-155表达水平升高，而miR-145在肺癌患者中表达水平较低，结合检测这三种microRNA有助于区分肺癌和健康吸烟者，其灵敏度为69.4%，特异性为78.3%。另一项研究显示[15]，运用Q-PCR分析法检测microRNA，与健康人相比，miR-125a-5p,miR-25和miR-126在肺癌患者血清中显著减低，联合检测这三种microRNA，能以87.5%的灵敏度和特异性区分早期肺癌患者。以上证据提示部分microRNA有可能成为肺癌早期诊断的新型无创性生物标志物。

3.2 MicroRNA用于肺癌的治疗随着免疫学、基因组学等学科的发展，探索有效治疗肺癌的新方法是目前基础研究领域的当务之急。MicroRNA作为一类控制中心基因表达的调控因子，作为生物治疗肿瘤的目标分子比基因编码更加有效，可利用microRNA的三种机制进行抗肿瘤治疗，减缓肿瘤的生长和播散，包括：(1)恢复肿瘤抑癌基因microRNA的表达；(2)灭活原癌基因的致癌活性；(3)调节microRNA的基因调控网络，恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

一些具有抑癌基因功能的microRNA在肺癌患者中呈低表达或抑制，可以采用基因转染的方式导入并激活相应microRNA的表达，从而达到潜在的治疗作用[16]。例如在肺癌动物模型中引入合成的let-7可以减小瘤体大小，体外组织培养也证明在人的肺癌细胞中导入let-7可以抑制细胞增殖。miR-93、miR-98、miR-197 通过下调抑癌基因FUS1 的表达而起到抑制肺癌生长，且与肺癌患者总体生存率密切相关。研究表明小鼠及人类肺癌中miR-34c,miR-145和miR-142-5p表达受抑制，通过进行转染可以显著抑制肺癌细胞的生长，发挥抗肿瘤效应。microRNA具有较低的毒性，并且能够“多靶向”，表明它们有潜力进入临床实践。 一方面通过增加microRNA中抑癌基因的表达，另一方面则通过抑制或者减少microRNA中致癌基因的表达，起到抗肺癌的作用[17]。如miR-145 可以通过下调c-myc 的表达来抑制肺癌细胞增殖，miR-let-7a 通过抑制KRAS 和c-myc 的表达来抑制以裸鼠为模型的肺癌细胞的生长，进一步深入研究microRNA中各种基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。

另外，对化疗或放射治疗的耐药性是当前肺癌治疗的一个障碍，而部分microRNA可改变肺癌细胞对不同药物或辐射的反应。在人类肺腺癌中低表达的miR-100通过丝/苏氨酸激酶信号通路,引起PLK1的高表达，导致肺腺癌细胞对多稀紫杉醇耐受，而高表达的miR-100可以恢复耐药细胞株对多稀紫杉醇的敏感性。Cortez等[18]研究显示microRNA-200c的过表达可通过直接调控氧化应激反应基因,抑制DNA双链断裂修复，提高活性氧水平，上调p21，增加肺癌细胞放射敏感性，从而发挥治疗潜力。虽然利用以上转染技术有望成为治疗肺癌的新靶点，但把microRNA 运用到临床治疗肺癌还有很多困难需要克服，包括microRNA药物的稳定性，在体内的传递、吸收及组织的特异性等。总体而言，基于microRNA的疗法仍处于初级阶段，但运用于临床仍是有潜力、有希望的。

3.3 MicroRNA用于判断肺癌的预后目前，肺癌的死亡率高，寻求判断肺癌预后的生物学标志物至关重要。研究表明，microRNA在肿瘤组织中有着不同的表达谱，通过检测肿瘤组织microRNA的表达谱，可以判断肿瘤的存在及生长情况，以便确定肺癌患者的预后。最新一项研究[19]表明miR-150在NSCLC中高表达，miR-150的表达水平与淋巴结转移、远处转移及临床TNA分期有关，分析显示在miR-150高表达患者中累积5年总生存率为40.8%，而在低表达组为69.2%。吕秀等[20]的研究显示血浆miR-4731-3p 在肺癌血浆中表达上调，可作为肺癌预后判断的潜在分子标志物。另外，有研究报道单个microRNA包括let-7、miR-34a、miR-374a、miR-181a、miR-221、miR-200c、miR-218等的低表达预示肺癌的低存活率或高复发性；一些microRNA包括miR-21、miR-183家族、miR-31、miR-16、miR-92a-2、miR-126等高表达则提示预后不佳。

其他标志物是基于多个microRNA的组合表达水平来了解肺癌的预后。血清中高水平的miR-486和miR-30d联合低水平的miR-1和miR-499可以显著预测NSCLC的不良预后。除microRNA水平外，microRNA甲基化状态的改变也可独立预测肺癌预后。miR-9-3和miR-124-2 / 3的甲基化与肺癌的晚期T分期有关，整个甲基化位点的数量越高，生存率越差。且miR-34b / c的甲基化与第I阶段的NSCLC高复发和低总体生存率独立相关[21]。因此，microRNA与肺癌的生存率密切相关，其可作为肺癌预后判断的有效指标。

4 结 语

MicroRNA不仅是许多癌症相关基因的调节者，而且是重要的癌基因或抑癌基因。而外周血中microRNA的稳定存在和可检测性，将有望用于肺癌的早期诊断、治疗以及预后的判断。但外周血microRNA对肺癌的调控是一个复杂网络，受多因素影响，将microRNA运用到临床尚有许多难题需要解决。因此深入探究microRNA与肺癌之间的作用及其作用机制，将有望成为肺癌患者的新诊断标志物及基因治疗的有效靶点。

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