结直肠癌相关长链非编码RNA的研究进展

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(1.南华大学医学院肿瘤研究所；肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属南华医院肛肠科)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。2012年全世界新增结直肠癌病例数为140万，位居恶性肿瘤第三位；结直肠癌死亡人数为69.39万，占恶性肿瘤总死亡人数的8%，位居恶性肿瘤第四位[1]。在中国，随着社会经济的快速发展及人口老龄化，结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁到人们的健康。虽然治疗手段不断改进，但由于结直肠癌发病隐匿，就诊时大部分为晚期，治疗效果不佳。伴有转移的患者5年生存率不足10%。虽然过去几十年在分子水平对癌症进行了广泛的研究，但对结直肠癌发生发展的分子机制认识仍然不足，应用于临床上新的诊疗方法进展缓慢。因此，迫切需要改进结直肠癌早期诊断方法和治疗策略。

随着基因组和转录组测序以及蛋白质组鉴定技术的快速发展，研究发现超过90%的人类基因组可被转录，但这其中只有不到2%编码蛋白质，大多数基因组转录产物是非编码RNA(ncRNA)。更重要的是，许多ncRNA已被证实参与基因表达调控，而不是转录的“噪音”。根据其长度，ncRNA通常分为两大类：小非编码RNA(small non-coding RNA, sncRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)。通常定义认为SncRNA在长度上小于200个核苷酸，其包括微RNA(miRNA)，Piwi相互作用RNA(piRNA)，转录起始RNA(tiRNA)，内源性小干扰RNA(endo-siRNA)等。 其中miRNA和siRNA已经被广泛研究，并确定为各种生物过程，特别是癌症发生发展的关键调节因子，包括细胞增殖、分化、凋亡、自噬、坏死、迁移侵袭和血管生成等。相对于sncRNA而言，lncRNA是长度超过200个核苷酸，缺乏开放阅读框架,不具有或很少具有编码蛋白能力的RNA分子。近年来，越来越多的证据表明lncRNA与许多疾病的发生发展相关，包括结直肠癌。多项研究表明，结直肠癌相关的lncRNA通过促进或抑制细胞增殖、凋亡、分化、侵袭和转移，参与结直肠癌进展的不同生物学过程。分子机制层面，lncRNA被报道参与基因表达调控的各个层次，包括表观遗传调控、转录调控和转录后调控。下面我们将总结结直肠癌相关lncRNA的功能及其分子机制研究的最新进展，并探讨其对结直肠癌诊断和治疗的临床意义。

1 lncRNA概述

随着RNA测序及生物信息学的发展，越来越多的lncRNA得到鉴定，目前研究认为lncRNA的形成方式有以下几种：1)染色质形态重构，2)蛋白编码基因发生改变，3)非编码RNA内部发生串联产生重复序列而构成新的lncRNA，4)非编码基因在复制过程中发生移位，5)基因中插入转座子[2]。根据lncRNA相对于相邻蛋白编码基因转录的位置，将其分为1)散发(它们起源于与相邻蛋白编码基因相同的启动子区域的相反链)和会聚(它们编码在相对的链上并彼此面对)；2)内含子(它们从另一个基因的内含子转录)；3)基因间(它们远离其他基因，通常> 10kb)；4)重叠正义(它们与同一链上的其它基因重叠)和重叠反义(它们与相反链上的其它基因重叠)；5)增强子RNA(他们表示为单向或双向转录本)；6)miRNA宿主基因[3]。LncRNA可位于细胞核或者细胞质中，研究表明lncRNA的生物学功能和其定位密切相关。很多研究集中在lncRNA参与基因表达调控的分子机制研究。研究表明，lncRNA主要通过以下几种机制参与基因表达调控：lncRNA可以在蛋白编码基因的上游启动子区域来干扰基因表达;通过抑制RNA聚合酶II的活性或通过染色质重塑和组蛋白修饰来影响多个基因的表达；干扰mRNA剪接模式，以通过与mRNA前体互补结合产生不同的剪接变体；通过直接结合蛋白质调节其活性；作为支架形成RNA-蛋白复合体；调节特异性蛋白质的亚细胞定位；也可作为调节基因表达的小RNA的转录前体。

2 lncRNA在结直肠癌中的功能及机制

2.1促癌(结直肠癌)作用的lncRNA 结肠癌相关转录物1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1)定位于染色体8q24.21，是由2628个核苷酸组成的lncRNA，位于转录因子c-Myc附近。He，等[4]发现c-Myc可以通过直接结合CCAT1启动子区域来促进其转录，CCAT1过表达增强了结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力。CCAT2定位于染色体8q24，是由1752个核苷酸组成的lncRNA。Ling，等[5]证实CCAT2在微卫星稳定型结直肠癌中高表达，促进肿瘤生长、转移和染色体不稳定。CCAT2通过TCF7L2介导的转录使c-MYC、miR-17-5p和miR-20a上调。进一步实验验证了CCAT2和TCF7L2之间相互作用，导致WNT信号传导活性的增强。同时CCAT2本身是一个WNT信号下游靶标，这表明存在一个反馈环。

HOX转录反义RNA(HOTAIR)是第一个发现具有反式转录调控功能的lncRNA，它位于染色体12q13.13。以前的研究表明，HOTAIR在许多肿瘤中起着重要作用，包括前列腺癌，胃癌，宫颈癌和乳腺癌。Kogo，等[6]报道，HOTAIR表达水平在结肠癌组织中高于非癌组织，HOTAIR高表达水平与肝转移和预后差相关，使用cDNA阵列数据的基因富集分析显示HOTAIR与PRC2复合物(SUZ12，EZH2和H3K27me3)及LSD1之间协同相互作用,从而诱导基因沉默。HOTAIR低表达抑制人类结直肠癌干细胞的生长。Wu，等[7]最近证实HOTAIR与结直肠癌的上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有关，HOTAIR敲除增加E-钙粘蛋白的表达，同时伴随波形蛋白和MMP9表达降低，作为一个多效的调控器参与EMT过程。总之，HOTAIR与CRC侵袭、淋巴结和器官转移、分化和肿瘤分期相关。

结直肠肿瘤差异表达(CRNDE)位于人类染色体16q12.2，由1070个核苷酸组成。CRNDE的表达具有组织特异性，并且遵循时间模式。在成年人结直肠粘膜、肝脏和白细胞中很少能检测到CRNDE，而在睾丸，乳腺和皮肤中可检测出CRNDE表达。此外，CRNDE表达在几种恶性肿瘤中明显增加，包括结直肠癌。研究发现存在两种CRNDE转录物：细胞质转录物(无内含子序列)和细胞核转录物(包含内含子序列)。胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF1)和胰岛素样生长因子2(IGF2)不影响细胞质CRNDE转录物，但通过PI3K/Akt/ mTOR和Raf/MAPK途径减少细胞核CRNDE转录物。敲低CRNDE高度保守区域gVC-In4，影响胰岛素信号反应以及葡萄糖/脂质代谢相关的基因。CRNDE增加GLUT4和MLXIPL转录。gVC-In4敲低降低葡萄糖摄入量，从而导致较少的乳酸盐分泌。CRNDE核转录物的表达增加促进CRC细胞中的葡萄糖代谢，乳酸分泌和脂质合成。CRNDE核转录物影响上游胰岛素(Insulin)/胰岛素样生长因子(IGF)信号通路。因此，通过PI3K/Akt/mTOR和Raf/MAPK途径，胰岛素、IGF1和IGF2抑制CRNDE核转录物，促进中枢代谢[8]。

肺腺癌转移相关转录本(MALAT1)是位于染色体11q13的lncRNA，也称作核富集常染色体转录物-2(NEAT-2)，其长度为8750个核苷酸。MALAT1 3′末端的一个片段(6918 to 8441 nt )对细胞增殖，迁移和侵袭生物学过程有一定的影响。Ji，等[9]报道，肿瘤抑制基因SFPQ和原癌基因PTBP2形成复合物，MALAT1结合SFPQ，从SFPQ/PTBP2复合物释放PTBP2，释放后的PTBP2促进细胞增殖和迁移。在体外实验中MALAT1过表达增强细胞增殖和迁移，促进裸鼠肿瘤生长和转移。在这个意义上，SFPQ介导MALAT1的调节作用。此外，MALAT1与SRPK1和SRSF1相互作用。 MALAT1通过促进SRPK1催化的SRSF1磷酸化而增加AKAP-9的表达。在MALAT1敲低后，SRPK1的过度表达恢复了SRSF1磷酸化和AKAP-9表达，促进体外细胞增殖，侵袭和迁移。相反，在结直肠癌细胞系中MALAT1过度表达后，SRSF1磷酸化和AKAP-9表达降低，并在体外抑制细胞增殖，侵袭和迁移。这些发现表明MALAT1通过促进结直肠癌细胞中SRPK1催化的SRSF1磷酸化增加AKAP-9的表达[10]。

H19位于人类染色体11q15.5，是一个含有2300个核苷酸的lncRNA。H19异常表达已被证实参与了各种癌症，包括结直肠癌。Liang等[11]最近将H19作为结直肠癌EMT的新型调节因子。H19在间充质样癌细胞和原发性结直肠癌组织中高度表达。稳定的H19表达促进EMT进展并加速体内和体外肿瘤生长。生物信息学与RNA沉淀实验(RNA immunoprecipitation，RIP)分析结合显示，H19作为miR-138和miR-200a的竞争性内源性RNA(ceRNA)，拮抗其功能，并激活其内源性靶向RNA分子Vimentin、ZEB1和ZEB2，而这些都是间充质细胞的关键标记。因此，H19作为竞争性内源性RNA促进EMT进程，从而促进结直肠癌的进展。Yang[12]等发现H19作用的另一机制，作为miR-200a的竞争性内源性RNA(ceRNA)，miR-200a 与H19结合并抑制其表达，从而降低结直肠癌细胞增殖。β-Catenin被鉴定为miR-200a的靶基因，H19通过竞争性结合miR-200a上调β-Catenin的表达和活性，促进细胞增殖。

Thorenoor，等[13]最近在结直肠癌组织中分析了相关lncRNA的表达，并鉴定了锌指反义1(ZFAS1)在结直肠癌组织中过表达。ZFAS1沉默后，细胞阻滞在G1期。通过RNA免疫沉淀(RIP)分析发现细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)与ZFAS1相互作用。生物信息学分析发现ZFAS1可以作为海绵吸附靶向CDK1的miR-590-3p。作者进一步表明ZFAS1激活CDK1和细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)。当ZFAS1沉默时，Cyclin B1降低。ZFAS1沉默同时激活P53，增加结直肠癌细胞凋亡。综合分析，ZFAS1通过抑制P53和增加CDK1/Cyclin B1复合物来促进细胞周期进程并抑制凋亡，因此其与结直肠癌细胞的细胞周期和细胞凋亡密切相关。

Niu，等[14]研究表明AK027294在结直肠癌组织中高表达，AK027294下调显著抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡。AK027294的潜在机制可能与caspase-3，caspase-8，Bcl-2，MMP12，MMP9和TWIST的调节有关。

CASC11在结直肠癌组织中过表达，与肿瘤大小，浆膜浸润，淋巴转移和肿瘤淋巴结转移(TNM)阶段正相关。CASC11在体外和体内促进结直肠癌细胞增殖和转移。CASC11增加异源性核糖核蛋白K(hnRNP-K)和β-catenin的表达，激活结直肠癌细胞中WNT/β-catenin信号转导[15]。此外，c-Myc直接结合CASC11的启动子区域，增加启动子组蛋白乙酰化，增强CASC11表达。

长江经济带建设是国家大战略，云南要寻找自身在战略框架中的定位。习近平总书记强调，要把长江经济带建设成为我国生态文明建设的先行示范带、创新驱动带、协调发展带。云南地处长江上游，集通江、达海、沿边于一体，具有贯通南太平洋和印度洋，连接中国、东南亚、南亚三大市场的特殊区位优势，是我国面向西南开放的重要桥头堡，是长江经济带各省区走向东南亚、南亚的重要战略支点，是建设面向南亚、东南亚辐射中心的前沿，在国家区域发展和对外开放格局中具有独特而重要的作用。长江经济带建设凸显了云南的战略地位，也赋予云南义不容辞的重要使命。

BLACAT1是最近鉴定的一个与癌症相关的lncRNA，在癌细胞中的各种生物过程中发挥调节功能。Su等[16]发现 BLACAT1过表达是结直肠癌的独立的不利预后指标，并且揭示BLACAT1敲低显著抑制结直肠癌细胞增殖。进一步的机制研究显示，BLACAT1在G1/G0阻滞中起关键作用，表明BLACAT1可通过结合EZH2抑制p15表达，从而促进结直肠癌细胞周期和增殖。

2.2抑癌作用的lncRNA LncRNA也可以作为肿瘤抑制因子，抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移。BANCR的表达受到癌基因BRAFV600E的影响。Shi，等[17]证实在三种结直肠癌细胞系中BANCR的表达显着降低。抑制BANCR后，通过下调p21导致结直肠癌细胞的增殖。DANCR高表达与TNM分期，组织学分级和淋巴结转移呈负相关。

母本印迹表达基因3(MEG3)是另一种结直肠癌增殖抑制因子。Yin，等[18]报道降低的MEG3水平与组织学低分化，肿瘤侵袭增加和晚期TNM呈正相关。进一步的实验表明MEG3过表达在体外和体内显著抑制结直肠癌细胞增殖。多变量分析显示，MEG3表达可作为总生存率的独立预测因子。

Pasic，等[19]在2010年报道了lncRNA LOC285194在骨肉瘤内抑制肿瘤细胞生长。Qi，等[20]证实，与正常肠粘膜细胞系相比，LOC285194在结直肠癌细胞系中减少。此外，低水平的LOC285194与增加的肿瘤大小，更晚的肿瘤分期，远处转移和无病生存率下降相关，LOC285194是p53的下游靶基因，其异常表达特异性地抑制miR-211的表达，从而抑制肿瘤细胞生长。

LncRNA LOC554202在乳腺癌和肺癌中被报道异常表达。Ding，等[21]研究表明，与正常人肠上皮细胞系相比，结直肠癌细胞系中LOC554202的表达显著降低。LOC554202表达下降与晚期病理分期和肿瘤大小有关。此外，LOC554202高表达在体外抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，阻止肿瘤的发生。

TINCR是另一个肿瘤抑制因子，其长为3700个核苷酸的lncRNA。 TINCR水平与结直肠癌细胞的生长和肿瘤的转移呈负相关。在生理条件下，TINCR结合EpCAM。TINCR的缺失增加EpCAM的水解，增加EpICD的释放，并激活WNT/β-catenin途径。c-Myc通过抑制SP1转录活性降低TINCR表达，建立一个控制c-Myc和TINCR表达的正反馈环。TINCR表达的缺失促进结直肠癌的增殖和转移，因此是潜在的癌症抑制基因[22]。

3 LncRNA在结直肠癌的临床应用

3.1 LncRNA作为结直肠癌诊断及预后生物标志物众所周知，CCAT1和HOTAIR在多种癌症中上调，为了验证其在结直肠癌诊断中的价值，Zhao，等[23]研究发现结直肠癌患者血浆HOTAIR和CCAT1水平均明显高于健康对照组。通过ROC分析，血浆CCAT1提供了较高的诊断性能(ROC曲线下面积(AUC)为0.836；敏感性为75.7%;特异性为85.3%)。此外，CCAT1与HOTAIR组合可以提供更有效的诊断性能(AUC为0.954，敏感性为84.3%;特异性为80.2%)。更重要的是，这种组合在早期检测结直肠癌有效，比单独的HOTAIR或CCAT1具有更高的结直肠癌阳性诊断率。

Liu，等[24]研究结果证实，来自结直肠癌患者血清中的CRNDE-h(CRNDE可变剪接异构体的一种)是稳定可检测。与结直肠良性疾病患者和健康群体相比，在148例结直肠癌患者中成功验证了血清中CRNDE-h的表达增加。CRNDE-h水平与结直肠癌区域淋巴结转移和远处转移显著相关。CRNDE-h可用于诊断结直肠癌(ROC曲线下面积为0.892，灵敏度为70.3%，特异度为94.4%)，优于癌胚抗原。此外，CRNDE-h高表达组的总生存率低于低表达组(高表达组：34.6%；低表达组：68.2%，P<0.001)。总之，CRNDE-h作为非侵入性血清肿瘤标志物，可用于结直肠癌的诊断和预后。

Li，等[25]证实，核富集常染色体转录物1(NEAT1)在结直肠癌中表达上调，与肿瘤分化、侵袭、转移和TNM分期呈正相关。增加的NEAT1表达水平与患者生存率降低相关。更重要的是，Cox比例风险分析显示，NEAT1表达增加是结直肠癌患者独立的不良预后标志。Wu，等[26]分析了血液中NEAT1在结直肠癌患者和正常对照组中的表达，结直肠癌患者全血NEAT1表达显著升高。此外，NEAT1升高的表达可能来自结直肠癌患者的嗜中性粒细胞。从这个意义上来看，全血NEAT1表达可能是结直肠癌的新型诊断生物标志物。

HOTTIP在结直肠癌中高度表达，并通过沉默p21促进结直肠癌细胞的生长，为了验证HOTTIP表达与结直肠癌患者进展和预后的关系。Ren，等[27]通过比较癌组织和相邻的非恶性组织，发现HOTTIP在结直肠癌中高表达，与TNM分期和远处转移呈正相关，同时还观察到，无论T期，远处转移和临床阶段如何，HOTTIP过表达可能是结直肠癌患者预后不良的指标。

Yin，等[28]研究发现，与邻近正常组织相比，GAS5在人类结直肠癌组织中显著下调，而较低的GAS5水平与肿瘤大小，组织学分级和晚期TNM分期相关。此外，GAS5表达和预后分析表明，GAS5表达较低患者的存活时间明显低于GAS5高表达的患者(P<0.001)。多变量分析显示,GAS5表达可以作为总生存期的独立预测因子(P<0.05)。由此可见，GAS5可能作为结直肠癌的预后生物标志物。

结直肠癌组织中RP11-462C24.1的表达降低。另外，CRC转移性患者的RP11-462C24.1水平降低。多变量分析确定RP11-462C24.1是患者预后的独立预测因子。RP11-462C24.1水平的降低也与无病生存率降低有关。RP11-462C24.1可能是结直肠癌的新型预后和诊断标志物。可以预见，越来越多的lncRNA将被发现能在作为结直肠癌患者的新型诊断生物标志物。

3.2 LncRNA在结直肠癌治疗中的应用晚期结直肠癌治疗失败的主要原因是化疗药物耐药性的发生，最近研究表明lncRNAs在耐药方面发挥重要作用。Li，等[29]通过转录组测序发现一些lncRNAs在奥沙利铂耐药(OxR)和非耐药结直肠癌患者的差异表达。进一步在组织和血清样品中进行RT-qPCR实验发现lncRNA MEG3在奥沙利铂耐药患者中明显下调。此外，血清MEG3表达降低与接受奥沙利铂治疗的结直肠癌患者的化学应答差和存活率较低有关。随后，研究者建立了OxR耐药细胞系(HT29和SW480)，并且发现在这两个耐药细胞中MEG3显著下调。流式细胞术分析表明MEG3促进结直肠癌细胞凋亡。总之，MEG3通过增强奥沙利铂诱导的细胞凋亡来促进化疗敏感性。因此，高表达MEG3可能是解决结直肠癌患者奥沙利铂耐药的新型治疗策略。

Gao，等[30]研究发现用奥沙利铂处理的结直肠癌细胞系敲除CRNDE后,可降低细胞活力，促进DNA损伤和细胞凋亡，而奥沙利铂处理CRNDE过表达的结直肠癌细胞系则降低了DNA损伤和细胞凋亡。进一步机制研究表明，CRNDE作为miR-136的竞争性内源性RNA，导致其内源靶标E2F转录因子1(E2F1)的激活。因此，CRNDE有望成为结直肠癌新的治疗靶点。

LncRNA UCA1作为miR-204-5p的竞争性内源性RNA来抑制miR-204-5p，从而调控CREB1/BCL2/RAB22A的表达，减弱细胞凋亡以及降低结直肠癌中的5-氟尿嘧啶(5-FU)化学敏感性。UCA1-miR-204-5p-CREB1/BCL2/RAB22A调节网络在结直肠癌患者的发病机制和耐药中起重要作用。LncRNA snaR下调在5-FU治疗后降低细胞死亡，这表明snaR缺失增加了结直肠癌中5-FU的耐药性[31]。另外研究表明SLC25A25-AS1的敲除能增强耐药性，促进与结直肠癌相关的EMT过程及其ERK和p38信号通路的激活。Linc00152作为miR-193a-3p的竞争性内源性RNA，增加了对结肠癌中奥沙利铂敏感性的ERBB4的水平。通过激活WNT/β-catenin信号，抑制AP-2α和进一步上调MDR/P-gp水平，诱导多药耐药(MDR)来鉴定结直肠癌相关的lncRNA对结直肠癌患者辅助化疗的反应。已经证明H19通过激活WNT/β-catenin途径介导甲氨蝶呤抗性，因此H19可能成为对甲氨蝶呤耐药的结直肠癌潜在的治疗靶点[32]。

4 展 望

与蛋白质一样，lncRNA在结直肠癌诊断、预后和治疗中具有广泛的应用前景。然而，由于lncRNA研究还处于起步阶段，lncRNA作为结直肠癌诊断、预后标志物或治疗靶点尚未应用于临床，目前有几个问题亟待解决，首先，体液或组织中某些lncRNA由于转录水平低、不稳定且容易降解，需要采用先进且可靠的lncRNA扩增和浓缩方案方能检测；其次，因为lncRNA功能的多样性及不确定性，从许多与结直肠癌相关的lncRNA中发现高度特异性和敏感性的生物标志物也是一个巨大的挑战。因此需要系统地发现和鉴定更多的lncRNA并阐明其机制，为结直肠癌的诊断和治疗开创新的篇章。

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