耳科学研究前沿进展

吴皓 陶永

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科上海交通大学医学院耳科学研究所上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

伴随着生物科学日新月异的发展，耳科学的基础研究也有了长足的进步。电子显微镜技术的发展，生物学已经在介观、微观领域取得诸多突破，听觉研究也从毛细胞延伸到突触及听觉中枢；基因编辑技术的进步，内耳的基因调控越来越精准、高效，耳聋模式动物的基因治疗有了重大突破；单细胞图谱理念的推广也使听觉发育的研究越来越精细化。近两年耳科学主要研究进展梳理如下：

1 耳聋机制研究

后天性聋（噪音性、老年性、免疫性、药物性等）的发病率日渐增高，其研究也越来越深入，尤其是后天性聋早期的突触病变以及免疫性耳聋的研究取得了一定的进展。通过突触退化及内耳免疫在耳聋发病机制的研究，可以探索耳聋发生机制并研发听力保护性治疗方案。

1.1 突触研究

噪音性聋和老年性聋在发病早期常无法检测到听阈的上移和螺旋神经节的凋亡，但近年来的深入研究表明听力下降早期即有突触的退化，称为“隐性听力下降”。耳蜗突触退化是造成“隐性听力损失”的主要原因，是噪音性聋和老年性聋的早期病理改变之一，也是噪音背景下言语识别率低的主要原因。螺旋神经节与毛细胞之间突触的消失早于毛细胞的凋亡，突触的缺失并不影响听性脑干诱发电位(ABR)的阈值，只能通过高分辨率的共聚焦显微镜检测。

噪音暴露后突触广泛的消失而不伴毛细胞明显凋亡的现象广泛存在于小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠和猴子。由于内毛和外毛细胞的突触前和突触后表达的离子通道和输入电阻的不同，内毛和外毛的突触敏感性有差异[1]。突触的退化可能和谷氨酸兴奋毒性有关，但具体机制尚不清楚，也缺乏有效的检测方式。激光的瞬时光波损伤可破坏大鼠外毛细胞的纤毛，并导致ABR阈值上移，免疫组化结果表明突触变少。这种单次高强度的刺激即可导致突触病变，表明突触损伤不需要谷氨酸长期刺激突触后膜[2]。

接受噪音暴露后的豚鼠，其毛细胞的突触退化后可有部分恢复，但是这可能只是突触连接或受体蛋白的短暂改变所致，不一定是因为突触再生[3]。小鼠的研究结果表明隐性听力损失是可以被部分治疗和预防的[4]。突触退化的研究不但有助于探明听力损失的病理机制，也为听力保护的策略研究提供新思路，同时也有利于研发更为敏感的听力检测方法。

1.2 内耳免疫

自身免疫性内耳病是免疫相关的以膜迷路积水、螺旋神经节变性、炎性渗出和毛细胞变性为主要表现的疾病。听觉创伤后对耳蜗进行RNA测序、基因芯片检测和实时定量PCR的研究发现，化学因子和细胞因子可以募集免疫细胞到耳蜗。目前已证实噪音损伤和耳毒性药物可诱发TLR4(Toll like receptor 4)激活、促炎细胞因子和化学因子释放等过程。有报道显示毛细胞受损后CX3CR1+(Chemokine(C-X3-C motif)receptor 1)巨噬细胞调节CD45+细胞大量释放[5]。

内耳存在免疫自适应现象，内耳细胞在免疫应答后表型不一的机制仍待研究。支持细胞和巨噬细胞参与了耳毒性过程，但是这些细胞如何感知耳毒性的发生？除了传统的钙离子信号通路，ROS和ATP信号通路也参与了耳毒性过程[6]。另外，CX3CL1/CX3CR1信号通路介导了毛细胞损伤后巨噬细胞对毛细胞的保护作用[7]。对能迁移进入耳蜗的免疫细胞类型的鉴定，并探明其参与内耳免疫应答中分泌因子的过程、细胞中的相互作用，鉴定内耳在损伤后免疫应答的损伤相关分子节律，可为耳毒性和噪音性聋相关药物研发提供靶点[8]。

2 毛细胞发育及再生

哺乳动物内耳毛细胞不可再生是内耳发育研究及耳聋治疗的瓶颈，近年来关于毛细胞发育的基因调控和毛细胞再生的探索取得了一定的成果。目前新生小鼠的毛细胞经调控后可实现再生，然而成年动物耳蜗仍不能实现毛细胞再生，是毛细胞再生领域最大的桎梏。

2.1 毛细胞发育

随着转基因动物制备周期的缩短，利用基因调控来研究毛细胞发育越来越便捷。代表性研究包括在毛细胞转分化之前敲除Six1(Sine oculis-related homeobox 1)基因可见毛细胞数目减少并伴感觉上皮的缺陷，表明转分化过程中的Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2)的下调依赖于Six1，实验表明Fgf8(Fibroblast growth factor 8)表达亦依赖于Six1[9]。Esrp1(Epithelial splicing regulatory protein 1)基因敲除小鼠可表现为耳蜗形态改变、毛细胞转分化和细胞寿命变化，说明Esrp1基因是耳蜗发育的关键基因之一[10]。小鼠耳蜗条件性敲除Stat3(Signal transducer and activator of transcription 3)基因可以抑制毛细胞的转分化，抑制Notch1信号通路可以促进STAT3的磷酸化[11]。Ick(Intestinal cell kinase)基因缺失可导致动纤毛IFT（Intraflagellar transport）异位表达，导致毛细胞极性的变化，从而影响听力，证明了纤毛运动与毛细胞极性之间的相关性[12]。支持细胞敲除Connexin26和Connexin30可阻止内毛细胞的成熟[13]。

2.2 毛细胞再生研究

Atoh1 是 basic helix-loop-helix(BHLH)家族转录因子，是毛细胞转分化的关键基因。Atoh1在E12.5开始表达后诱导支持细胞向毛细胞转分化，最近证实Sox2下调是Atoh1激活形成毛细胞的必要条件，可解释虽然顶圈细胞更早退出有丝分裂期，但Atoh1的表达和转分化从底圈开始[14]。

哺乳动物内耳中具有类似干细胞性质的听觉祖细胞，通过分选不同部位Lgr5(Leucine rich repeat containing G protein coupled receptor)阳性和阴性的细胞后利用RNA-seq对细胞进行分析比对，发现了一系列与细胞增殖及转化相关的分子特异性地在Lgr5阳性的祖细胞之中表达并与细胞的再生能力直接相关，针对这些分子进行调控极有可能增强毛细胞再生。转分化的研究也有不少进展：Notch信号通路中的Hes/Hey转录因子可以通过结合Atoh1启动子区域在发育过程中调控细胞命运[15]，通过调控多个细胞命运相关的基因p27,Atoh1,Pou4f3(POU domain,class 4,transcription factor 3)等实现了在成年动物中毛细胞的功能性再生[15]。表观遗传性在毛细胞再生中的作用取得了一定进展，包括组蛋白去甲基化酶LSD1通过与毛细胞发育及转分化相关的H3K4调控甲基化修饰水平以及相关基因表达，为斑马鱼毛细胞再生所必需[16]。microRNA如mir-183、mir-210的发现亦为实现支持细胞到毛细胞的转分化提供了新思路[17,18]。

除了调控支持细胞的基因实现再生，研究人员也致力于在体外诱导分化出毛细胞，再使用细胞治疗的方法将新的毛细胞植入内耳完成再生。借助于近年来日趋成熟的类器官培养方法，诱导的人类多能干细胞可向听觉细胞分化并最终获得了具有电生理功能的毛细胞[19]。Lgr5阳性听觉祖细胞的3D培养体系通过优化条件实现了体外高效率的毛细胞诱导分化[20]。这些体外诱导技术能够高度模拟生理条件下的内耳中细胞复杂的调控系统。已有研究利用小鼠胚胎干细胞3D分化系统揭示了组蛋白抑制性蛋白复合物对于听觉细胞发育重要因子Pax2(Paired box gene 2)的表观遗传调控机制[21]。

3 听觉保护研究

得益于转化医学理念的深入，耳聋的研究逐渐从实验室走向临床，目前在欧美已经有多项耳聋治疗的临床研究。基础研究-临床实验这一模式的成功，既为耳聋的治疗提供更多手段，也极大推动了耳聋的基础研究。

3.1 促进毛细胞再生的药物

已有不少针对毛细胞再生从而改善听力的临床试验正在开展。其中美国诺华制药公司自2014年开始的利用腺病毒载体将Atoh1基因导入迷路实现支持细胞到毛细胞转分化的实验，目前已处于二期临床（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02132130）阶段。小分子药物方面，应用Notch信号通路抑制剂LY356480治疗感音神经性耳聋也已在欧洲进入二期临床（ISRCTN59733689）。美国Frequency Therapeutics的新型转分化药物FX-322的经鼓膜注射方案在澳洲进入临床一期研究(ACTRN12617000704392）。未来几年可能有更多进入临床的再生药物。

3.2 保护性药物

目前已知的保护听力下降的临床药物实验有：JNK激酶抑制剂（鼓室凝胶）、Atoh1转录因子（迷路注射）、D-蛋氨酸（口服）、N-乙酰半胱氨酸（口服/鼓室给药）、硫代硫酸钠（全身给药）和依布硒啉（口服），均为I-II期临床实验。除了Atoh1调节毛细胞再生外，其他药物皆是通过抑制氧化应激来减少噪音或耳毒性药物对毛细胞的损伤。

4 耳聋治疗研究

小鼠是研究内耳基因治疗常用动物模型，耳蜗中阶、圆窗、卵圆窗是内耳基因治疗的传统手术径路。近年来利用经典的病毒和热门的CRISPR/Cas9，通过基因替代、基因沉默、基因编辑等方法在内耳基因治疗上均取得一定进展。

4.1 病毒载体

腺病毒在内耳转染的研究已有20多年历史。腺病毒可以转染内耳细胞，但有一定的耳毒性[22]。不同血清型的腺相关病毒（AAV）可以转染内耳不同类型细胞，通过计算机技术研发合成的AAV2/Anc80L65可以高效转染耳蜗毛细胞[23]。除了提高病毒本身的转染效率，亦有研究证实Exosome可协助蛋白、核酸进入细胞，并可以提高AAV在内耳的转染效率[24]。

随着病毒效率的提高，利用病毒载体成功治疗遗传性耳聋的报道有：AAV8-whirlin通过后半规管注射可以部分恢复Whirlin-/-小鼠的听力和前庭功能[25]；Ush1c综合征表现为先天性耳聋、前庭障碍和色素性视网膜炎，Ush1c突变小鼠不能正确翻译harmonin蛋白，经圆窗注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b可以恢复听力和前庭功能[26]；AAV携带人工合成miRNA可以结合于Tmc1(Transmembrane channel-like gene family 1)突变基因，抑制突变基因的转录，从而抑制显性遗传导致的听力下降[27]。

现阶段基因治疗仅限于小鼠新生阶段干预，首要原因是缺少安全有效的手术径路，最近证实成年小鼠后半规管注射可以转染耳蜗细胞，为成年小鼠基因治疗提供了技术支持[28]。

4.2 基因编辑

随着CRISPR/Cas9基因编辑工具效率的提高，利用基因编辑工具在体治疗遗传性疾病成为可能。核糖核酸蛋白（RNP）介导的CRISPR/Cas9可在小鼠耳蜗毛细胞进行基因编辑并敲除Math1-GFP小鼠的GFP基因[29]。Tmc1点突变(c.T1235A)小鼠表现为迟发性耳聋，经RNP介导的CRISPR/Cas9治疗后听力明显恢复，毛细胞存活率明显提升。基因测序结果表明基因编辑脱靶率极低，证实了内耳基因编辑的安全性[30]。首次证实了可通过基因编辑技术实现内耳基因精准治疗，为遗传性耳聋的治疗提供了新的途径。基因编辑治疗的优势在于可精准靶向致病基因，而且彻底去除了遗传性耳聋的病因。

4.3 干细胞移植

人的体细胞可在体外诱导成多能干细胞。目前可通过基因调控分化为有功能的毛细胞，提供了人类内耳细胞的体外筛选平台[19]。干细胞移植一直是耳聋治疗的潜在方案，骨髓、脂肪和脐带来源的间质干细胞是可能的方案。随着干细胞技术的发展，骨髓来源的间质干细胞是最有可能用于内耳细胞的替代治疗方案[31]。

4.4 神经营养因子

新生阶段大鼠内耳注射腺病毒介导的NT-3(Neurotrophin-3)可以加速大鼠听力的发育，表明了NT-3可能参与了听觉发育过程[32]。噪音暴露前在小鼠耳蜗圆窗注射NT-3可以促进突触的再生[33]。噪音暴露前利用AAV在小鼠内耳过表达NT-3，可明显避免噪音导致的突触丢失[34]。

5 前庭系统研究

前庭系统高通量转录组学和蛋白组学使毛细胞转录、纤毛发育、损伤后的细胞应答、非哺乳动物毛细胞再生的机制研究有了新的进展。而前庭细胞多态性的分子机制、脊柱动物前庭细胞成熟性/可塑性调控、前庭自发再生后的功能恢复以及前庭神经元的再生仍是研究的难点[35]。

通过单细胞RNA-Seq已经重现了新生小鼠椭圆囊毛细胞转分化过程中的基因表达变化，可以进一步研究I型、II型前庭毛细胞及支持细胞等不同细胞亚型在发育阶段的基因表达差异，从而建立相应的筛选文库[35]。然而如何证实这些差异基因是必需的调控基因是研究的瓶颈。

通过胚胎干细胞诱导分化可以在体外培养出前庭感觉上皮细胞，并能检测到有机械门控通道的I、II型前庭毛细胞[36]。

随着体外3D器官培养技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展，前庭系统基因调控研究借助这些高通量研究技术可以很快推进。

6 耳科研究新技术

显微镜技术的发展和在体成像技术的提高，使得耳科学的研究可以在保持听觉通路完整性的前提下开展，也可以在更微观的层面探索听觉机制。

6.1 双光子技术

单光子共聚焦显微镜已经在耳科学得到了广泛应用，但仅限于观察平面组织。双光子成像具有高分辨率、高速、可穿透一定厚度组织的特点，可以非侵入地对在体组织进行观察。通过荧光蛋白或荧光染料标记，或是结合光遗传学，将细胞中的定位与表达技术相结合，可在生命体和细胞仍具有活性的状态下对其功能进行动态观察。可以研究处于生理状态的活体动物的神经系统。双光子技术已经是神经科学研究的重要工具，也逐渐在耳科研究中得到应用。将分离的小鼠耳蜗孵育于含钙离子敏感的染料（Oregon Green BAPTA 488AM）培养基，在卵圆窗进行机械刺激模拟声波振动基底膜，用双光子成像系统记录外毛细胞的钙离子变化，从而实现保持耳蜗器官完整性的同时进行听觉生理研究[37]。

6.2 活细胞成像

非侵袭性活细胞成像和标记技术为内耳形态研究提供了时空动态、高清记录的可能。Light-sheet显微成像技术可以记录长时间活体组织影像，并且多维度、长时程、高分辨率、光毒性小，为内耳组织结构学研究提供新的可能[37]。

组织透明质化和激光切割工具的出现，为基底膜的机械生物力学研究增添了新的工具[38]。

综之，耳科学在近年来呈现蓬勃发展的势头：研究的手段越来越多，研究的领域越来越广，研究的程度越来越深，无论是基础研究还是转化研究都取得了可喜的成果。希望在国内外耳科研究人员的共同努力下，共同推动学科的跨越式发展。

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