白藜芦醇通过诱导自噬改善高脂饮食小鼠非酒精性脂肪肝

陆奇群 张 曦

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）指除酒精和明显的肝损害因素之外的其他原因导致的，病理特征为肝细胞弥漫性大泡性脂肪变性的临床综合征[1]。在我国NAFLD患病率达20.9%～42%[2-3]。NAFLD可进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至转变为肝细胞癌（HCC）[4]。NAFLD患者罹患2型糖尿病（T2DM）及其并发症的风险明显高于正常人[5]。流行病学调查[6]显示，NAFLD为骨质疏松、冠心病和结直肠肿瘤的高危因素。白藜芦醇（resveratrol，Res）为一种非黄酮类多酚化合物，已被证实可有效改善NAFLD小鼠肝脏病变程度[7]。自噬（autophagy）在NAFLD的发生、发展中发挥重要作用。自噬可降解肝细胞内脂滴，减轻炎症反应，改善肝细胞脂肪变性[8]。本研究从自噬角度出发，观察Res对NAFLD小鼠的改善作用及其对自噬相关蛋白p62和通路蛋白磷脂酰肌醇-3-羟基激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、丝氨酸-苏氨酸激酶（serine-threonine kinase，AKt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的影响，探讨Res治疗NAFLD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物 健康SPF级雄性C57BL/6J小鼠45只，6周龄，体质量18～20g，购自浙江大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（浙）2016-0031。Res购自南京泽朗医药科技公司，批号160504。

1.2 主要试剂和仪器 胰岛素酶联免疫（ELISA）试剂盒，购自美国R&D公司，批号SJH16887。血糖试纸购自深圳瑞迪恩科技公司，批号TS21DD4Q2409。p62（批号 51145）、PI3K（批号 42925）、Akt、mTOR 一抗（批号29725）购自美国Cell Signaling公司。二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，批号166818B。Western blotting相关试剂购自江苏碧云天生物技术研究所。DXC 800全自动生化仪购自美国Beckman公司。

1.3方法

1.3.1 造模和分组 参照文献[9]予高脂饲料（68.5%基础饲料＋15%猪油＋1%胆固醇＋15%糊精＋0.5%胆盐）共8周复制小鼠NAFLD模型，并经肝脏病理检查符合NAFLD判断标准[10]。将45只C57BL/6J小鼠随机分为模型组、观察组和正常对照组，各15只，均自由饮水。模型组和观察组予高脂饲料复制NAFLD模型。造模成功后，模型组予高脂饲料＋生理盐水10mL/kg，1天1次灌胃，观察组予高脂饲料＋Res 100mg/kg，1天1次灌胃，连续2周。正常对照组始终予基础饲料。

1.3.2 标本采集 给药结束后，禁食12h，以2%戊巴比妥麻醉后，股动脉放血法处死小鼠，取3mL血离心取上清以检测血清学指标，同时取肝脏组织适量制成匀浆用于Western blot检测。

1.3.3 血清学指标 血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平采用全自动生化仪检测。血清空腹血糖（FBG）和胰岛素（FINS）水平分别采用试纸和ELISA试剂盒测定。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=FINS（mU/L）×[FBG（mmol/L）/22.5][11]。

1.3.4 Western blot检测p62及通路蛋白 取适量肝脏组织经匀浆离心后，加蛋白裂解液，提取总蛋白。取30～50μg蛋白，经10%SDS-PAGE凝胶100V 1h电泳后转至硝酸纤维素膜，封闭液中37℃ 2h；加入 p62、PI3K、Akt、mTOR 一抗 4℃过夜。反复洗膜1h，加入二抗孵育1h，洗膜后加入ECL发光剂孵育5min，置于凝胶成像系统中成像。采用Gel Pro3.0软件测定条带积分光密度值（OD），以目的蛋白的OD值与内参的OD值的比值作为目的蛋白的相对OD值。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件处理，计量资料采用（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清学指标比较 与正常对照组比较，模型组血清TG、TC、ALT、AST水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，观察组血清 TG、TC、ALT、AST水平均显著降低（P＜0.05）。各组FBG水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常对照组比较，模型组HOMA-IR水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，观察组HOMA-IR水平显著降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠p62及通路蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型组肝组织中p62、PI3K、磷酸化（p）-Akt、p-mTOR 水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，观察组肝组织中 p62、PI3K、p-Akt、p-mTOR 水平均显著降低（P＜0.05）。见图1（插页）、表 2。

图1各组小鼠p 62及通路蛋白的表达

3 讨 论

NAFLD的发病机制较为复杂，遗传因素、代谢紊乱、脂质过氧化及炎症因子失衡等多种因素均发挥重要作用，而胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）为公认的关键因素。IR可促进脂质代谢紊乱，促使过多的游离脂肪酸向肝细胞聚集，进一步加重肝细胞脂肪变[11]。而且，过多游离脂肪酸可损伤线粒体，并造成氧化应激，产生大量氧自由基（ROS）[8]。

表1 各组小鼠血清学指标比较（±s）

表1 各组小鼠血清学指标比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；TG：甘油三酯，TC：总胆固醇，ALT：谷丙转氨酶、AST：谷草转氨酶，FBG：血清空腹血糖，HOMA-IR：胰岛素抵抗指数

组别正常对照组模型组观察组只数151515TG（mmol/L）0.72±0.124.55±0.28*1.86±0.18*△TC（mmol/L）3.15±0.268.79±0.35*5.36±0.31*△ALT（U/L）35.24±2.15154.18±8.33*55.62±4.35*△AST（U/L）51.39±3.87297.47±8.96*86.54±5.26*△FBG（mmol/L）5.38±0.455.52±0.475.46±0.42HOMA-IR 1.53±0.192.26±0.23*1.64±0.22△

表2 各组小鼠肝组织p62及通路蛋白表达比较（±s）

表2 各组小鼠肝组织p62及通路蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；PI3K：磷脂酰肌醇-3-羟基激酶；p-AKt：磷酸化丝氨酸-苏氨酸激酶；p-mTOR：磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

组别正常对照组模型组观察组只数151515p620.97±0.061.45±0.08*1.04±0.07△PI3K 0.87±0.051.52±0.06*0.96±0.07△p-AKt 0.85±0.051.64±0.08*0.94±0.08△p-mTOR 0.68±0.031.12±0.04*0.59±0.02△

自噬（autophagy）为真核生物特有的进化上高度保守的分解代谢方式，广泛参与机体的生理病理过程。研究[12]表明，自噬与NAFLD之间存在密切关系。研究[13-14]表明，自噬可降解肝细胞内的脂滴，进而改善脂肪肝。自噬相关基因Atg5敲除的小鼠高脂饮食后肝细胞内脂质含量较正常鼠明显增加。相反，自噬激动剂雷帕霉素可明显降低肝细胞内的脂质含量[15]。而且，自噬可通过线粒体自噬来吞噬降解损伤的线粒体，进而减轻氧化应激[16]。p62为公认的自噬特异性底物及评价“自噬潮”的标志物。自噬发生时，p62水平下降；而自噬受抑制后，p62水平上升[17]。研究[18]表明，p62蛋白能解除Beclin1与Bcl-2之间的结合，游离Beclin1从而促使自噬的发生。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）属于进化上较保守的丝氨酸/苏氨酸激酶之一，参与细胞发育、核糖体生成及代谢调控等生理过程，与糖尿病、心血管疾病及肿瘤疾病等多种疾病密切相关[19]。mTOR能负向调控细胞自噬体的形成，其活化程度能间接反映自噬水平。mTOR调控细胞自噬主要通过mTOR依赖性和非依赖性两条信号通路发挥作用[20]。雷帕霉素可抑制mTOR活化，导致其下游p70S6激酶（S6kinase）活性降低，进而促进自噬发生[21]。研究[22]发现，磷脂酰肌醇 3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/mTOR信号通路在自噬中发挥重要的调节作用，针对该信号通路的选择性抑制剂在治疗肿瘤方面已取得较为满意的效果。

白藜芦醇广泛存在于如葡萄、花生及藜芦等中，是一种天然的植物抗毒素，具有如抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节等生物学作用[23]。研究[24]发现，Res具有减轻肝细胞的脂质过氧化损伤，并改善肝脏功能。研究[25]显示，Res可能通过下调肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPARγ）、脂肪酸结合蛋白（FABP）表达，进而发挥改善NAFLD的作用。研究[26]发现，白藜芦醇能上调NAFLD大鼠肝内AMP活化的蛋白激酶（AMPK）与沉默信息调节因子1（IRT1）表达，而下调固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）表达。目前针对NAFLD中Res对自噬影响的研究报道不多。

本研究显示，Res干预可显著改善脂代谢、IR和肝功能（P<0.05），与前期研究结果一致；同时，Res干预可显著降低p62、PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平（P<0.05），这表明Res可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路进而诱发自噬。由于本研究样本例数和设计的局限，Res对自噬的促进作用及其具体的mTOR信号通路尚需进一步研究证实。

综上所述，Res可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路进而促进自噬，最终发挥改善NAFLD的脂代谢、IR和肝功能的作用。

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