基于Aβ25—35诱导的PC12细胞损伤模型研究定志小丸治疗阿尔兹海默病的作用机制及配伍机制

郑妍 刘舒 宋凤瑞 刘志强

摘 要 利用β-淀粉样蛋白片段Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型，从细胞凋亡及氧化应激两个通路研究定志小丸对Aβ25-35引起的PC12神经细胞损伤的保护作用，并将定志小丸拆方为单味药及三味药， 用以阐明定志小丸治疗阿尔兹海默病的作用机制、配伍机制以及主要活性药味。通过MTT和乳酸脱氢酶含量测定评估定志小丸及各味药对PC12细胞活力的影响，其中人参、茯苓效果最好，与模型组相比，可使细胞活力提高约30%。通过细胞凋亡、线粒体膜电位（MMP）、丙二醛（MDA）及还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定，进一步从细胞凋亡及氧化应激两个通路研究定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导PC12细胞保护作用，研究结果表明，人参、茯苓效果最优，不仅可以显著抑制细胞凋亡，还可降低丙二醛（MDA）含量，减少膜脂过氧化； 远志、石菖蒲可以通过提高细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）含量进而抑制氧化应激损伤，且与人参、茯苓配伍后，可促进主要成分发挥药效，显著提高人参、茯苓的药效。人参、茯苓是定志小丸中的主要活性药味，远志、石菖蒲起辅助增强药效的作用。

关键词 定志小丸； 拆方； 配伍作用； Aβ25-35； PC12细胞； 细胞凋亡； 氧化应激

1 引 言

阿尔茨海默病（AD）是一种以认知能力丧失为特征的神经退行性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变以及语言障碍。由于缺乏有效的治疗药物，使得AD对患者及其家人都是一种毁灭性的疾病[1]。目前，AD的发病机制仍不十分明确，β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑后，诱导神经元氧化应激导致神经细胞损伤甚至死亡，进而导致认知功能进行性退化，是目前公认的主要发病机制之一[2，3]。因此，大量研究致力于筛选抗氧化剂和抗凋亡药物作为潜在的AD治疗药物[4～9]。

中药复方虽然成分复杂，但可以通过多成分作用于疾病相关的多个靶点而发挥协同治疗作用，效果好且副作用较少，这与现代药物集中单一靶点治疗疾病不同。越来越多的学者致力于研究中药对于AD的预防以及治疗作用[4，10～15]。定志小丸（DZXW），源于唐代孙思邈的《备急千金要方》，由人参（GR）、茯苓（P）、远志（PR）和石菖蒲（ATR）四味药按照质量比3∶3∶2∶2 的比例组成，人参为“君药”，茯苓为“臣药”，远志和石菖蒲为“佐药”，已在临床上应用多年，主要用于治疗抑郁症、焦虑症、神经衰弱、阿尔茨海默病及帕金森病等病症[16～18]。之前的研究已经确定了定志小丸中的64种主要活性成分，包括人参皂苷、三萜类化合物、远志皂苷、寡糖酯、蔗糖酯、山酮糖苷等[19]。在药理学研究方面，目前大部分研究都集中于人参、远志单味药或某一种有效成分对于AD的治疗作用[20～23]，定志小丸的作用机制及配伍机制尚不明确[24]。为了评价药物对AD的潜在治疗效果，目前已建立了多种细胞模型用以研究药物对神经细胞的保护作用，常用细胞模型有研究脑源性神经营养因子作用所使用的转染SH-SY5Y细胞系[10，25～27]，以及研究Aβ蛋白沉积导致细胞毒性和神经元损伤所使用的Aβ诱导的PC12细胞损伤模型[3，15，20，21，28，29]，其中Aβ诱导的PC12损伤模型是目前应用最为广泛的AD治疗药物体外活性评价模型。Aβ聚集后可以通过氧化应激、细胞凋亡等多种机制造成AD患者神经元大量丢失和突触损伤[30]，在AD的发病过程中起关键作用。大量研究通过考察PC12细胞在Aβ蛋白介导下的氧化应激及细胞凋亡通路的变化考察药物对AD的治疗效果，如通过加入花青素可以显著提高PC12细胞抗氧化应激能力[7]，加入淫羊藿素后可以抑制细胞凋亡、减少LDH泄露及线粒体膜电位的降低[31]。

本研究使用Aβ蛋白诱导的PC12细胞损伤模型研究定志小丸对神经细胞损伤的保护作用，选择Aβ蛋白中毒性最强的Aβ25-35活性片段[32]。考察了定志小丸在細胞凋亡和氧化应激两种机制下对PC12细胞的保护作用，其中细胞凋亡通路主要通过MTT实验、LDH漏出量测定、流式细胞仪检测细胞凋亡（ANNEXIN V-FITC/PI双染色法及线粒体膜电位）等方面进行检测； 氧化应激通路主要检测与氧化应激反应密切相关的抗氧化剂还原型谷胱甘肽（GSH）及膜脂过氧化的重要产物丙二醛（MDA）的含量变化。为了阐明定志小丸的作用机制、配伍机制及主要活性药味，除定志小丸外，还将其拆方成单味药GR、P、PR、ATR及三味药GR+P+PR、GR+P+ATR、GR+PR+ATR、P+PR+ATR，通过比较在细胞凋亡及氧化应激通路上对PC12细胞的保护作用的差异，阐明定志小丸配伍的科学合理性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

BDAccuri C6流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）； Milli-Q超纯水处理系统（美国Milford公司）； AL104 型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； MCO175型二氧化碳培养箱（日本Sanyo公司）； SpectraMax i3型酶标仪（美国Molecular Devices公司）； Allegra X-30R型离心机（美国Beckman公司）。

茯苓、远志、石菖蒲均购自河北凯达公司； 人参购自吉林抚松； 所有中草药均由吉林省中医药科学院黄青教授鉴定。Aβ25-35（Sigma-Aldrich公司，货号A4559，Mw=1060.26，白色固体粉末）； DMEM高糖培养基（HyClone公司）； 胎牛血清（BI公司）； 噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）； 大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株（中国科学院上海细胞库）。考马斯亮蓝（50T）、丙二醛试剂盒（50T）、乳酸脱氢酶试剂盒（96T）和还原型谷胱甘肽试剂盒（96T）均购自南京建成公司； ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（50T，Solarbio公司）； 罗丹明123（1 mg/mL，北京鼎国公司）。

2.2 中药提取物制备

提取方法参考文献[33]，取50 g的定志小丸用75%乙醇回流提取2次，每次提取时间为2 h，提取液为生药量的8倍。合并两次提取液，过滤、减压浓缩至50 mL，得到定志小丸质量浓度即生药量为1 g/mL 的提取液。拆方后的单药和三味药的提取方法与定志小丸提取方法相同。

2.3 Aβ25-35老化处理

参照文献[34]的方法，将Aβ25-35用高压灭菌PBS（KH2PO4-NaHPO4，10 mmol/L， pH=7.2）缓冲盐溶液配制成浓度为1 mmol/L的溶液， 37℃孵育72 h，使用时用高压灭菌PBS缓冲盐溶液稀释为20 μmol/L[35]。

2.4 PC12细胞培养及MTT检测细胞活力

PC12细胞培养于含10%（V/V）胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基中，并加入1% 青霉素-链霉素溶液。在含有5% CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。隔天换液，2～3天传代，取对数生长期的细胞用于实验。使用MTT法检测细胞活力，实验分4组： 空白组、对照组、Aβ25-35模型组及Aβ25-35和中药提取液共同作用组。将PC12细胞以4 × 103 /孔的密度种于96孔板上，培养24 h后，共同作用组将培养基替换为100 μL含10% FBS的DMEM培养基溶解的不同浓度的中药提取物溶液，继续培养24 h，其它3组更换新鲜培养液继续培养24 h。随后加入Aβ25-35诱导损伤24 h，其中对照组只更换培养液， 不加入Aβ25-35。弃去培养液，加入100 μL 1 mg/mL MTT孵育4 h后，去除MTT溶液， 并加入150 μL DMSO振荡10 min。使用酶标仪检测570 nm波长下的吸光度值，计算细胞存活率（Survival rate， SR）。

2.5 ANNEXIN V-FITC/PI检测细胞凋亡

PC12细胞接种于6孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，收集各组细胞，使用冰PBS清洗两次。使用试剂盒内缓冲盐悬浮细胞，300×g离心10 min，再用缓冲盐重悬细胞，将细胞稀释至1×106 个/mL。每管加入100 μL细胞及5 μL Annexin V-FITC，室温下避光混匀10 min后，再加入5 μL PI室温避光孵育5 min。 加入PBS至500 μL，轻轻摇匀，孔径75 μm （200目）尼龙网过滤，使用流式细胞仪检测： FITC： 激发波长488 nm，发射波长530 nm； PI： 激发波长535 nm，发射波长615 nm。

2.6 线粒体膜电位（MMP）检测

将PC12细胞接种于6孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，收集各组细胞（约1×106个/mL），使用预热的PBS缓冲液洗涤两次，将罗丹明123加入至细胞悬液。37℃下孵育30 min，粒径75 μm（200目）尼龙网过滤后， 使用流式细胞仪分析，激发波长488 nm， 发射波长530 nm。

2.7 乳酸脱氢酶（LDH）含量测定

使用LDH测定试剂盒，通过受损细胞释放到培养液中的LDH定量测定PC12细胞的损伤。经药物和Aβ25-35处理后，收集各组细胞培养上清液，根据试剂盒测定方法处理样品，使用酶标仪测定450 nm吸光度值，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，高速离心后， 使用BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度。

2.8 还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定

将细胞接种于96孔板，使用药物及Aβ25-35干预后，用冰PBS清洗2次，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，高速离心后， 使用BCA蛋白定量试剂盒定量分析蛋白浓度，GSH含量用试剂盒测定。

2.9 丙二醛（MDA）含量测定

将PC12细胞接种于6孔板，干预结束后使用冰PBS清洗2次，使用RIPA裂解细胞，离心取上清液，先进行蛋白定量分析，使用MDA试剂盒测定MDA含量。

2.10 统计学分析

实验数据经SPSS 18.0软件进行统计分析，所有数据以均数（x）±标准差（s）表示，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，p<0.05认为具有统计学差异。

3 结果与讨论

3.1 定志小丸、拆方后单药、三味药及Aβ25-35对PC12的细胞毒性

由表1可知，生药量为1 mg/mL的9种中药提取物作用于PC12细胞48 h后，细胞活力与对照组并没有显著性差异，在此浓度下，药物对于细胞并无毒性，因此选取1 mg/mL生药量作为后续实验的加药浓度。

3.2 定志小丸及拆方后单药、三味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞毒性的抑制作用

图1所示，与对照组相比，模型组Aβ25-35诱导的PC12细胞的活力明显下降，说明20 μmol/L Aβ25-35对PC12细胞有明显的毒性，加入1 mg/mL的不同中药提取物后，PC12细胞活力显著增加，其中人参、茯苓效果最为明显。

3.3 定志小丸及拆方后的各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC可与磷脂酰丝氨酸（Phasphatidylserine，PS）特异性结合。在细胞凋亡早期，细胞膜失去对称性，PS暴露于细胞膜外，可被Annexin V-FITC结合， 从而成为识别细胞凋亡的标志。但是坏死细胞的PS同样外路露于细胞膜外，因此加入碘化吡啶（PI）以区分坏死细胞。凋亡早期细胞膜仍保持完整性，PI不能进入细胞内，而处于凋亡晚期和坏死的细胞可同时被Annexin V-FITC/PI著色，可以准确反映凋亡过程。流式细胞仪Annexin V-FITC双染法检测结果显示，PC12细胞在培养或处理过程中有自发凋亡的现象，但凋亡率较低（图2A），经20 μmol/L Aβ25-35处理24 h后，凋亡细胞显著增加，凋亡率达到71.4%（图2B）。经单味药人参、茯苓（图2C、D）处理后，细胞凋亡率显著降低，说明这两味药在抑制Aβ25-35损伤时起主要作用。

3.4 ANNEXIN V-FITC/PI法观察细胞凋亡的形态学变化

采用ANNEXIN V-FITC/PI双染色法研究细胞凋亡变化和细胞损伤。该方法可将早、中、晚期及死细胞区分开来。正常的活细胞，ANNEXIN V-FITC和PI均为低染，不着色； 细胞凋亡早期，ANNEXIN V-FITC高染， 细胞膜呈现绿色荧光，PI低染，细胞核不着色； 细胞凋亡中、晚期，ANNEXIN V-FITC和PI均高染，细胞膜呈现绿色荧光，细胞核呈现紅色荧光[36]。如图3所示，通过激光共聚焦显微镜观察，对照组（图3A）所选区域无明显细胞异常且无凋亡细胞，模型组（图3B）中PC12细胞显示出核聚集，细胞突起回缩，PI染色发出红色荧光。经定志小丸提取物处理后的细胞（图3C-3K）其细胞凋亡发生了显著的改善。其中，经人参、茯苓和定志小丸处理过的细胞变化尤为明显，无凋亡晚期细胞，且细胞形态与健康细胞并无明显差异。

3.5 定志小丸及各味药抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞线粒体膜电位的下降

线粒体膜电位（MMP）在启动线粒体介导的凋亡途径中起关键作用。MMP降低是细胞凋亡早期的重要特征之一[37]。如图4A所示，与对照组相比，加入Aβ25-35作用24 h后，MMP显著降低，PC12细胞经中药提取物处理后再加入20 μmol/L Aβ25-35作用24 h，MMP均有显著升高。说明定志小丸及拆方后的各味药均能抑制Aβ25-35带来的MMP降低，其中人参、茯苓单味药效果最为显著。

3.6 定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞中LDH释放的影响

当PC12细胞处于氧化应激状态下时，细胞处于易损状态，LDH漏出率会明显增加[38]。LDH水平越高，说明其细胞损伤越严重。如图4B所示，模型组LDH漏出率高出对照组70%，经定志小丸及拆方后各味药保护后，均可以显著抑制LDH漏出，其中人参、茯苓单味药效果最好，抑制漏出率可达40%以上。

3.7 定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞内MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的重要产物，其含量高低可以作为考察细胞受损程度的指标之一，MDA的主要危害是导致膜脂过氧化，损伤生物膜结构，使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行[39]。如图4C所示，模型组与对照组相比，MDA含量显著升高，说明Aβ25-35可以造成细胞膜脂质过氧化，经定志小丸及拆方后各味药保护后，MDA含量有不同程度降低，其中人参、茯苓单味药效果最好。

3.8 定志小丸及各味药对Aβ25-35诱导的PC12细胞GSH含量的影响

GSH是细胞内主要的非蛋白巯基化合物，是细胞中含量很高的一种抗氧化剂，其含量的微小变化就可以影响细胞的氧化还原平衡，因此在保护细胞抵抗氧化应激方面具有重要的作用[40，41]。经定志小丸提取物作用后的PC12细胞中GSH含量均显著性增加，其中远志、石菖蒲单药作用效果最好（图4D）。

4 结 论

本研究构建了Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型，从细胞凋亡和氧化应激两个角度对定志小丸治疗AD的作用机制及配伍机制进行了研究。通过比较定志小丸及其对应的单味药及三味药在细胞凋亡及氧化应激通路上对PC12细胞保护作用的差异，阐明了定志小丸配伍的科学合理性： 人参、茯苓在维持细胞活力方面发挥主要作用，同时可以显著降低MDA含量，减少氧化应激损伤，是定志小丸中的主要活性药味； 远志、石菖蒲可促进GSH增加，主要通过中药配伍后的协同作用促进人参与茯苓两味药的治疗效果。本研究结果表明，Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型，是一种简单、稳定、实验周期短的细胞模型，不仅可以用于评价药物治疗AD的疗效和研究其作用机制，并且还可以用于阐释复方中药的配伍机制。

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