RAPD分子标记对工业大麻诱变材料的分析

姜 颖，张丽娜，潘冬梅，韩承伟，王晓楠，曹 焜，韩喜财，孙宇峰

（1.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

大麻（Cannabis sativaL.）为大麻科（Cannabinaceae）大麻属（CannabisL.）一年生草本植物［1-2］，在我国已有 5 000多年的栽培利用历史，是我国传统经济作物，具有重要的工业及药用价值［3-4］。采用欧盟的划分标准即THC＜0.3%为无毒大麻即工业大麻，世界各国都只允许种植工业大麻。大麻的产品利用涉及纺织、服装、造纸、军需、化工、建材、生物能源、食品及制药等多个方面［5-9］。因此，培育高产、优质、高纤、低毒的工业大麻新品种尤为重要。

诱变育种是利用物理或化学的诱变剂处理植物材料如种子、植物或其他器官，使其遗传物质发生改变，产生各种突变，然后在发生突变的个体中选择符合人们需要的植株进行培育，从而获得新品种。随机扩增多态 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）具有操作简便、不需提前知道材料基因信息、检测灵敏、多态性强等特点，是目前研究植物种群遗传变异、种质资源评估、栽培植物品种鉴定等方面广泛采用的一种分子标记法［10］。RAPD技术现已广泛应用于作物育种、分子生物学、生态学、植物抗病性以及植物质量性状的标记等研究领域。鉴于此，本研究利用RAPD分子标记技术对EMS化学诱变和Co60-γ射线物理诱变进行变异分析，为工业大麻突变产生提供充分的分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 化学诱变材料的创建与选择

试验于2015年4月28日至2016年9月24日在黑龙江省大庆市东风农场进行。用pH 7.5、0.1 mol/L磷酸钾缓冲液和二甲基亚砜（DMSO）配制EMS，设0、0.4%、0.8%、1.25%、2.0% 5个EMS浓度，对火麻一号工业大麻种子分别浸种处理6 h后，用0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液冲洗5次，每次静置5 min以终止反应［5］。然后播种，行距0.30 m，株距0.03 m，田间管理按一般试验田进行，按单株收获。将收获的M1代种子第二年继续播种，小区面积为2.0 m×2.0 m，采用单粒点播，行距0.30 m，株距0.06 m。田间管理按一般试验田进行，适时收获M2代种子。

1.2 物理诱变材料的创建与选择

利用Co60-γ射线对五常40、农安2、火麻一号、格里昂、格里西亚5个工业大麻干种子进行处理，设5个剂量，分别为0、50、100、150、200 Gy，剂量率为0.10 Gy/min。处理后的种子直接播种于温室，田间管理按一般试验田进行，适时收获M1代种子。

1.3 RAPD分子标记鉴定

将收获的工业大麻种子整齐排列在铺有滤纸的培养皿中，置于人工气候培养箱内，24℃恒温、光下进行发芽试验，一段时间后取叶片样品，液氮中速冻，存于-80℃待用。取100 mg样品经液氮研磨后，用ProbeGene公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，最后溶于100 μL洗脱缓冲液EB中备用。

RAPD分子标记反应体系：ddH2O 8.0 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，DNA 1.0 μL，Primer 1.0 μL。反应条件：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 1 min、复性36℃ 1 min、延伸72℃ 2 min，35个循环；再延伸72℃ 5 min，4℃保存。所选引物［11］如表1所示。

表1 大麻RAPD分析适宜的引物及核苷酸序列（5′-3′）

1.4 数据处理

采用Gel-Pro analyzer软件对扩增条带进行分析，转换成“0”和“1”；然后利用NTSYSpc（W）软件和SLT_NTsys_2.10e软件结合，进行树状图的构建。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取

由于大麻含酚类化合物较多（目前已报道的有61种），在DNA的提取过程中极容易被氧化［12］，本试验利用DNA提取试剂盒可获得纯度较高的DNA样品（图1），RAPD分析标记以提取的DNA样品为模板进行PCR反应。

图1 诱变材料叶片中提取的DNA

2.2 化学诱变材料的RAPD分析

选择24株EMS诱变材料进行RAPD分子标记分析，引物OPV-08扩增结果如图2所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从图3可以得出，与对照相比基因差异性最大的为c19、c20、c23，其EMS诱变浓度为2%。

图2 引物OPV-08扩增结果

2.3 物理诱变材料的RAPD分析

2.3.1 农安2 选择19株物理诱变的农安2材料进行RAPD分子标记分析，引物OPI-07扩增结果如图4所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图5）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c13、c14、 c18、c19，其诱变剂量在150～200 Gy之间。

图3 火麻一号化学诱变树状图

图4 引物OPI-07扩增结果

图5 农安2物理诱变树状图

2.3.2 火麻一号 选择29株物理诱变的火麻一号材料进行RAPD分子标记分析，引物OPP-12扩增结果如图6所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图7）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c14、c15、c19、c20，其诱变剂量在100～150 Gy之间。

图6 引物OPP-12扩增结果

图7 火麻一号物理诱变树状图

2.3.3 五常40 选择13株物理诱变的五常40材料进行RAPD分子标记分析，引物OPU-12扩增结果如图8所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图9）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c10、c11、 c12、c13，其诱变剂量为150 Gy和200 Gy。

图8 引物OPU-12扩增结果

图9 五常40物理诱变树状图

2.3.4 格里昂 选择11株物理诱变的格里昂材料进行RAPD分子标记分析，引物OPZ-13扩增结果如图10所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图11）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c7、c8、c9，其诱变剂量在150～200 Gy之间。

图10 引物OPZ-13扩增结果

图11 格里昂物理诱变树状图

2.3.5 格里西亚 选择12株物理诱变的格里西亚材料进行RAPD分子标记分析，引物OPY-11扩增结果如图12所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图13）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c8、c12，其诱变剂量在150～200 Gy之间。

图12 引物OPY-11扩增结果

2.3.6 金刀15 选择33株物理诱变的金刀15材料进行RAPD分子标记分析，引物OPX-13扩增结果如图14所示。对11个引物扩增的结果进行分析，构建树状图，从结果（图15）可以得出，与对照相比基因差异性较大的为c18、 c20，其诱变剂量为100～150 Gy。

图13 格里西亚物理诱变树状图

图14 引物OPX-13扩增结果

图15 金刀15物理诱变树状图

3 结论与讨论

本试验结果表明，在2%EMS诱变处理工业大麻种子6 h时，后代发生的突变率最高。Co60-γ射线诱变后，农安2、五常40、格里昂、格里希亚的诱变材料与对照基因差异性较大的处理剂量在150～200 Gy之间；火麻一号的诱变材料与对照相比基因差异性较大的为c14、c15、c19、c20，其诱变剂量在100～150 Gy之间；而金刀15的诱变材料与对照相比基因差异性较大诱变剂量为100～150 Gy之间。与对照差异显著的诱变材料，其诱变浓度或剂量与之前筛选的适宜诱变浓度或剂量相近。化学诱变浓度是2.0%，处理6 h［5］；Co60-γ诱变剂量基本都在150 Gy左右［13］，所以笔者认为RAPD分子标记也可以作为诱变浓度或剂量的筛选标准。

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