细胞生物起搏器的研究新进展

常青，于晓龙，高静媛，刘香素，梁芳倩

作者单位：1 063000 唐山,河北省唐山市华北理工大学附属医院老年病科

目前，植入电子起搏器是治疗缓慢心律失常以及病态窦房结综合征的主要方法，虽然在技术上相当娴熟，但它依然存在诸多并发症，如感染、金属过敏、电极脱位、电子干扰和对神经激素缺乏反应性等。这些缺点使得人们迫切需要寻找更接近心脏生理功能的生物起搏器，来进一步提高患者的生活质量[1]。

心脏生物起搏是利用细胞分子生物学及其相关技术，对受损的自律性节律点或发生传导障碍的特殊传导系统的组织进行修复或替代，使心脏的起搏和传导功能得以恢复。从心脏的生理功能和人体适应性的角度来看，生物起搏治疗是更为理想的治疗方式，并且在大型动物研究中进行的实验也均证明生物起搏是重建窦房结细胞起搏功能的有效方式[2]。目前生物起搏治疗方法主要包括基因生物起搏及细胞生物起搏。但单纯的基因生物起搏存在转染靶向及转染效率的不确定性，使人们逐渐选择了细胞生物起搏治疗。在本研究中，我们结合近年来国内外最新文献报道，对细胞生物起搏疗法的研究现状及存在问题进行综述。

1 心脏起搏细胞的分子机制

1.1 心脏起搏细胞电生理机制心脏的特殊传导系统具有自律性，但特殊传导系统不同部位的心肌细胞的自律性存在差别。窦房结细胞（SAN）的自动节律性兴奋的频率最高，是正常起搏点，主导整个心脏兴奋和搏动。其自律性主要是通过以下机制形成：窦房结细胞是钙钟（细胞内肌桨网，Ca2+clock）和膜钟（窦房结细胞膜多种离子流）相互作用，两者联合调整窦房结细胞的自律性[3]。窦房结细胞的肌浆网通过膜上兰尼碱受体（RyR）释放钙离子，激活钠钙交换，Ca2+钟引发膜钟从而爆发动作电位。膜离子通道的循环激活和失活、肌浆网节律性自发释放钙离子共同调节窦房结细胞，维持窦房结细胞稳定的自律性和起搏性。

1.2 心脏起搏细胞HCN通道1976年，Noma和Irisawa在兔窦房结细胞上发现了一种超极化激活内向电流，称为“起搏电流（If）”[4]。研究表明，起搏电流是窦房结细胞舒张期自动去极化的主要决定因素，并在心率控制及神经递质对心率的调节中起重要作用。而超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道（HCN）基因家族则是起搏电流形成的分子机制。HCN基因家族有4个成员，分别是HCN 1～4。每一种亚型都含有6个跨膜区域和1个环核苷酸结合区域（CNBD）化激活的阳离子通道—环核苷酸门控通道（HCN）从而参与去极化的形成。HCN通道具有4种功能[5]：①控制起搏活动；②调控细胞静息电位；③调控细胞膜电阻和树突整合；④调控突触传递。

HCN基因家族中只有HCN1、HCN2、HCN4在心脏表达，主要以HCN2和HCN4为主。HCN2在不同动物上表达部位有差异：在小鼠HCN2主要分布在窦房结组织，在大鼠心房肌组织和浦肯野纤维上表达较多，在兔主要分布在心室肌组织，在人类心室肌表达较多，并可诱发内向离子流。研究表明[6]，将HCN2基因直接注射到狗心脏不同部位，在迷走刺激下均观察到源于注射部位且频率较快的起搏节律，约130～160 次/min。同样，HCN4在不同动物上表达部位也有差异：HCN4在兔、小鼠和人的窦房结组织中高表达，在大鼠的心室肌中高表达，在犬的浦肯野纤维和窦房结组织高表达。已有研究表明[7]，HCN4基因突变会导致窦房结功能障碍。

2 细胞作为载体构建生物起搏

目前来说，细胞型生物起搏器的种子细胞来源主要有3种方法： ①干细胞诱导；②基因转染；③细胞融合。

2.1 干细胞诱导起搏种子细胞的选择大致为窦房结原代细胞[8]、脂肪干细胞[9]、骨髓间充质干细胞[10]、胚胎干细胞[11]、心肌干细胞[12]等。主要以骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞为主。

间充质干细胞（MSCS）是再生医学领域中具有广阔前景的多能干细胞。骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源于中胚层，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，即“干细胞可塑性”，可诱导分化为起搏细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和脂肪细胞等[13]。目前，主要的诱导方式有两种，分别是化学诱导和微环境诱导。化学诱导主要以5-氮胞苷为主，研究表明[14]，5-氮胞苷诱导的BMSCs能够分化为表达HCN2通道蛋白以及If电流的类起搏细胞。但此类诱导剂具有细胞毒性并可致突变，因此，化学诱导值得商榷。微环境诱导在一定程度上符合机体生长环境，并具备诱导所需的因子和活性集团，无细胞毒性和致突变性。此类诱导方式可分为直接诱导和间接诱导。直接诱导是将骨髓间充质干细胞和窦房结细胞（心肌细胞）或组织共培养，利用骨髓间充质干细胞的多向分化能力，彼此的机械剪切力和所分泌的活性集团，诱导使其成为具有起搏功能的细胞[15]。研究表明[16]，骨髓间充质干细胞可与心肌细胞相互作用，并表达连接蛋白40和43（connexin 40 and connexin43），形成缝隙连接和开放HCN通道，产生起搏功能且其稳定性能保持很久。间接诱导是将窦房结细胞或者心肌细胞反复冻融制备裂解液，使其释放出所含细胞活性因子，从而去诱导骨髓间充质干细胞。研究表明[17]，用鼠窦房结裂解液去诱导自身骨髓间充质干细胞，诱导后骨髓间充质干细胞能表达HCN2，并产生超极化激活的起搏电流，其诱导分化率随窦房结细胞裂解液浓度升高而升高。Zhang等[18]在猪的完全性房室传导阻滞模型中，将猪骨髓间充质干细胞移植到自体心脏后产生If电流并表达HCN4，可明显提高心率。因此，对于骨髓间充质干细胞，不论直接诱导还是间接诱导及自身移植都在一定程度上具有有效性。此外，骨髓间充质干细胞能从自体骨髓中获取，容易分离纯化及扩增培养，其与胚胎干细胞相比优势明显，不存在免疫排斥及伦理等问题，且易于整合外源基因，故应用BMSCs分化为特殊心肌细胞治疗缓慢型心律失常具备一定的潜力，其已成为病态窦房结综合征生物起搏治疗中比较理想的载体细胞。

胚胎干细胞是常见的多能性干细胞（PSCs）之一。研究表明[19]，选用胚胎心脏祖细胞为种子细胞，用内皮素-1可诱导为起搏细胞，再以胶原海绵和matrigel基质胶为支架材料，已成功构建成体外搏动的细胞支架复合体，移植入大鼠左心室室壁后，心电图可以观察到单个、成对室早及室性心律。但是，胚胎心脏祖细胞应用到临床可能会面临伦理学和免疫排斥反应等问题，从而限制了其临床应用。

2.2 基因转染运用生物、基因工程技术导入起搏基因或起搏相关基因可提高干细胞自律性。主要的基因转染载体有腺病毒、慢病毒、脂质体以及电打孔等多种方法，其中最常用的腺病毒转染[20]。通过基因转染形成的干细胞源性起搏细胞类似于内源性窦房结细胞，存在起搏基因表达和电流特征。研究表明[21]，将人HCN1基因通过慢病毒载体转染到骨髓间充质干细胞，用全细胞膜片钳分析记录转染HCN1的MSCs中的起搏电流（If），可检测到4 μm氯化铯抑制的高电压和时间依赖的内向超极化电流，表明HCN1基因可在MSCs中表达，其起搏频率达129±11 次/min（n=5）。Li等[22]在实验中发现，将鼠骨髓间充质干细胞通过腺病毒转染Tbx18转录因子，可诱导成起搏细胞。矮小同源框基因家族的成员Shox2和Tbx3这两个转录因子在胚胎时期对窦房结起搏功能起到重要作用。在基因筛选过程中发现，鼠类胚胎早期阶段，Shox2的表达会加强胚胎干细胞向起搏细胞的分化，其可能机制是Shox2上调起搏基因HCN4使其自律性加强[23]。当Shox2被敲除后，心脏收缩频率会减慢，但此阶段转染Shox2时会增加心脏窦房结细胞比例[24]。Shox2缺陷的小鼠胚胎会表现出包括窦房结区在内的静脉窦心肌发育不全和缺乏心脏起搏相关基因Tbx3和HCN4的表达。Tbx3基因在窦房结发育过程中控制窦房结基因的编程并维持起搏，缺失后会导致在小鼠胚胎窦房结内出现心房基因的表达，失去部分窦房结特异性起搏位点。研究表明[25]，当转染HCN4到多能干细胞（PSC）源性的心肌细胞，它会产生一个丰富的If电流和一个弱的内向整流性钾电流（IK1），显示更频繁的自发性搏动和较强的起搏能力，部分移植能够恢复心率。虽然胚胎心脏祖细胞免疫原性很小，易产生免疫耐受，但仍难避免免疫排斥反应的发生，如果应用到临床也可能会面临伦理学和免疫排斥反应等问题。

2.3 细胞融合细胞融合是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，将两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象[26]。目前，常用的细胞融合方法有：仙台病毒（seV）诱导法、水疱性口炎病毒（VSV）诱导法、聚乙二醇（PEG）诱导法、电融合诱导法、激光融合法等。在细胞生物起搏方面，最常用的是聚乙二醇（PEG）诱导法，即将表达特殊离子通道的细胞融合到窦房结细胞或心肌细胞，再移植到体内并产生起搏电位。有研究表明[27]，利用聚乙二醇作为诱导剂，将表达HCN1的同系成纤维细胞与新鲜分离的豚鼠心肌细胞融合，结果发现，融合后的细胞表现出自主性动作电位，频率随β肾上腺素能刺激而增加，即通过细胞融合后形成的异核体细胞在体内注射部位能够产生起搏活性。这种方法的优点是，不仅可以收获和使用自体细胞，而且是非病毒，非干细胞的方法，可避免病毒载体及其并发症；缺点是通过细胞融合技术构建的细胞生物，并没有在体内表现出一致且稳定的起搏频率。

3 生物起搏器的移植方式

在干细胞移植方式上，干细胞移植途径、干细胞靶向归巢数量、移植的时机、位置及移植后在组织中停留的时间等都是值得考虑的问题。目前主要由三种移植方式，分别是心肌内注射、冠脉内注射以及静脉内注射移植，主要以前两种较为常见。不论何种移植方式，都应力求简便、安全、高效、并发症少等。研究表明[28]，与静脉移植组相比，心肌内直接注射移植能够明显改善心脏的收缩功能、抑制心室结构的扩张重构，并在早期实验中可表现出较好的安全性和可行性。若在以后的研究中采用导管微创植入，不仅可以消除机械起搏器带来的并发症，而且可重复操作性强，感染风险小，这将为再生医学的细胞替代疗法提供新的途径。

4 生物起搏器的存在问题

随着分子和细胞生物学技术快速发展，构建细胞型生物起搏器是治疗病态窦房结综合征理想的方法。在临床应用之前，存在以下几个问题：①移植后细胞在体内保留的时间是所有细胞治疗的最重要的问题，目前还不清楚移植的窦房结细胞在心脏存活时间。当通过腺病毒转染Tbx18 基因到猪体内，观察到生物起搏细胞的活性峰值在第8 天，然后逐渐减慢，并且可出现昼夜心率不同，这可能与体内生理活动有关，其持续时间之短和不稳定性难以应用于临床；②移植细胞可诱导快速性心律失常。将人BMSCs和新生鼠心肌细胞共培养，发现形成的细胞集落传导速度降低，分析原因可能是心肌细胞和无兴奋性的BMSCs形成缝隙连接导致心律紊乱，也可能与移植后致心脏交感神经重构引发心律失常；③用于治疗病窦综合征、心衰以及心律失常所用的负性变时药物能够抑制生物起搏器的起搏能力；④干细胞诱导、病毒转染和细胞融合技术都可能存在基因突变和并发肿瘤疾病的隐患。

5 结论

通过干细胞诱导和基因转染方式构建的细胞型生物起搏器，为缓慢型心律失常患者的治愈带来了希望。间充质干细胞具有多向分化潜能，能从自体获取，易分离纯化及扩增培养，不存在免疫排斥及伦理等问题，且易于整合外源基因，是生物起搏治疗中比较理想的载体细胞。而转染HCN2或HCN4基因可使干细胞表达起搏电流，然后移植表达有起搏电流的干细胞可以用于治疗缓慢型心律失常。但是，细胞生物起搏真正应用于临床尚有很多路要走。生物起搏的靶基因的选择、安全有效和可控的体内基因运载体系以及干细胞的安全性等诸多问题尚未完全解决。但生物起搏器代替电子起搏器仍是未来发展的方向，相信不远的将来，通过人们不断的实验探究，生物起搏器可以安全有效的用于缓慢型心律失常患者的治疗中。