粪便DNA检测在结直肠癌筛查中的研究进展

铁宝霞 杨波 桑伟 孙晓月孙鹏进 闫柯 高峰

作者单位：730050 兰州 1甘肃中医药大学 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室；2兰州军区总医院结直肠肛门外科

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内癌症相关死亡第2大常见原因［1］，在我国位居恶性肿瘤病死率第 5 位［2］，发病率在发展中国家呈上升趋势［1，3］。CRC发生发展是多因素、多步骤的过程，美国通过有效地筛查和切除癌前病变，CRC发生率每年下降2%，但早期CRC检出率仍不足5%［1］，因此探索CRC筛查和早期诊断方法仍是该领域学者共同努力的方向。粪便DNA检测作为一种新兴的非侵入性筛查方法，在CRC筛查中具有较大应用前景。本文就近年粪便DNA检测在CRC筛查和早期诊断中的研究进展作一综述。

1 CRC粪便DNA检测原理

结直肠黏膜表面细胞不断脱落到肠腔，脱落后的癌细胞比正常结直肠黏膜上皮细胞有生存优势，正常结直肠黏膜上皮细胞在原位发生凋亡，或从基底膜分离时迅速退化，然后被巨噬细胞吞噬；而结直肠癌细胞通常可抵抗并逃脱失巢凋亡而保持完整，可持续从结直肠黏膜脱落［4］。脱落的癌细胞排出体外期间可暂时存在于黏液层而进一步得到保护［5］。但难以从右侧结肠肿瘤患者收集完整的结肠细胞［6］。因此，检测发育不良的癌细胞成分比全细胞检出率更高。同时肿瘤大量发育异常细胞及其成分脱落进入肠腔，亦为粪便检测提供了分析标本。结直肠属于碱性环境，DNA能在粪便内稳定存在［7］，且保持完整，较片段化DNA更易检测［8］。此外，可从粪便标本中分离DNA进行生物标志物分析，用于CRC或腺瘤早期检测。肿瘤最常见的表观遗传学改变是DNA异常甲基化，而DNA甲基化常发生在结直肠癌早期，易在患者粪便中检测。

2 CRC粪便DNA单基因检测

2.1 腺瘤性结肠息肉病基因

腺瘤性结肠息肉病基因（adenomatous polyposis coli gene，APC）位于染色体 5q21-22，长约 108 kb，属于抑癌基因，负责调控Wnt信号通路中生长促进基因诱导因子β-连环蛋白（β-catenin）。APC基因突变发生在CRC早期阶段，突变的APC蛋白不能下调和抑制Wnt信号通路中的β-catenin，但可能导致其免于降解，使游离的β-catenin在细胞质内集聚并进入细胞核，从而激活下游相关靶癌基因，导致肿瘤发生［9］。有研究报道，APC基因突变可引发结直肠腺瘤性息肉，也可直接导致家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）发生［10］。Traverso 等［11］检测 28例非转移性CRC患者及18例肿瘤直径＞1 cm腺瘤患者粪便样本中APC基因突变情况，结果26例被检出APC突变（敏感性为57%），而对照组均未检出。以上研究提示，APC基因突变与CRC早期事件发生关系密切，检测APC基因可能有助于CRC筛查。

2.2 p53基因

p53基因位于染色体17p，全长16～20 kb，是目前发现的与人类肿瘤相关性最强的抑癌基因。在CRC中，p53基因突变主要发生在进展期腺瘤向癌转变阶段，亦是此过程的关键因素。钟选芳等［12］在CRC筛查中发现p53基因在CRC和结直肠腺瘤中的突变率达65.2%和25.0%，而正常组不存在突变。刘三红等［13］从20例CRC手术切除肿瘤组织和术前粪便中分别提取DNA，发现癌组织均有p53外显子5～8特异性扩增产物，其中发生突变12例；粪便标本80%有p53特异性扩增产物，8例检测到相同的基因突变，p53突变的检出敏感性为66.7%。提示CRC患者或CRC癌前病变患者粪便中均可能存在p53基因突变，其在CRC患者粪便和肿瘤组织中亦存在。因此，粪便中突变的p53基因或可作为早期发现CRC或CRC癌前病变的重要生物标志物，对其检测可作为结直肠癌筛查的重要辅助手段。

2.3 K-Ras基因

K-Ras基因属于Ras基因家族，位于染色体12p，编码蛋白属三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白类，主要参与细胞信号转导。K-Ras基因突变使GTP蛋白稳定处于活化状态并持续信号传递，导致细胞无控制增生并恶性转化。在K-Ras基因突变中，主要是密码子12、13和61突变。吴伟等［14］观察散发性CRC K-Ras基因12、13密码子位点突变情况，发现12和13密码子均可发生突变，12密码子突变发生率最高，且易出现淋巴结转移。Li等［15］鉴定CRC和结直肠晚期腺瘤患者粪便中K-Ras基因的突变情况，突变率分别为82.4%和80.0%，且粪便样本（45.0%）和参考组织样本（55.0%）的突变检测率高度一致。综上，目前K-Ras基因已应用于临床，但仅限于血液和肿瘤组织检测，对结直肠癌筛查有一定价值，在粪便DNA检测中的应用仅在研究阶段，未应用于临床。

2.4 痉挛性截瘫-20基因

痉挛性截瘫-20 基因（spastic paraplegia 20，SPG20）定位于13q13.3染色体，编码Spartin多功能蛋白。研究证实SPG20基因甲基化与CRC密切相关。Lind等［16］研究显示，在CRC或腺瘤细胞中SPG20基因启动子区域呈异常高甲基化状态，而正常黏膜中没有SPG20高甲基化。Zhang等［17］收集96例CRC患者癌组织和粪便样本以及30份健康者粪便样本，结果显示，在组织样本中，85.4%发生SPG20超甲基化；在CRC患者粪便样本中，80.2%发生SPG20超甲基化，特异性为100%，粪便SPG20基因甲基化检测结果与组织检测结果基本一致。提示粪便SPG20基因甲基化或可代替结直肠癌组织作为CRC诊断的非侵入性生物标志物。

2.5 分泌型卷曲相关蛋白2基因

分泌型卷曲相关蛋白2基因（secreted frizzled-re lated protein，SFRP2）是分泌性糖蛋白家族的重要成员，亦是肿瘤Wnt/β-catenin信号通路的拮抗因子之一。有研究报道，当SFRP2基因发生甲基化而导致转录沉默时，其对Wnt信号的拮抗作用减弱或消失，从而导致肿瘤发生［18］。Zhang等［19］分析 48 例 CRC 患者、35例腺瘤患者、32例增生性息肉和30名正常人粪便样本中SFRP2基因启动子的甲基化状态，结果发现56.3%的CRC患者、51.4%的腺瘤患者和12.5%的增生性息肉患者检测到高甲基化的SFRP2。有报道［20］SFRP2启动子甲基化是非常敏感的粪便DNA检测单一标志物。Kriegshäuser等［21］应用甲基化特异性反向杂交法（methylation-specific reverse hybridization，MSRH）检测18例CRC患者和22名健康志愿者SFRP2基因启动子甲基化状况，以荧光定量法作为参照，两种测定方法均显示CRC患者SFRP2基因启动子被甲基化，检测结果一致。综上认为，粪便DNA中高甲基化的SFRP2是一种新型的分子生物标志物，对诊断早期CRC有较好应用前景。

2.6 磷酸酶肌动蛋白调节因子3

磷酸酶肌动蛋白调节因子3（PHACTR3）定位于20q13.32-q13.33染色体，全长281.3 kb。Rasmussen等［22］系统评价了31篇涉及粪便样本的文献，发现在粪便样本中，超甲基化的PHACTR3与早期CRC相关。Bosch等［23］研究发现，与正常结肠黏膜相比，晚期肿瘤的PHACTR3基因甲基化水平增加了70倍以上，粪便PHACTR3基因甲基化诊断CRC的敏感性达66%，特异性为100%，诊断进展性腺瘤的敏感性为32%。PHACTR3基因是一个新发现的CRC高甲基化基因，在CRC筛查中亦有一定应用前景。

3 CRC粪便DNA多基因联合检测

早期关于CRC粪便DNA的研究多限于单基因突变检测，但其灵敏度并不理想。近年，学者致力于粪便多基因多靶点联合检测研究，以寻求最佳敏感性和特异性组合。

3.1 K-Ras、APC、p53、BAT-26 和 BRAF 基因

Binefa等［24］分析了26例CRC患者粪便中的K-Ras和p53基因，发现多靶点检测可提高粪便DNA的敏感性和特异性。Yang等［25］采用L-DNA分析K-Ras、p53和APC基因突变和微卫星不稳定性标记BAT-26，其联合检测CRC的敏感性为91%，特异性为93%。Oh等［26］在对4 000多例受试者的大型多中心研究中，发生结直肠浸润性癌粪便DNA检测的敏感性是粪便隐血试验的4倍（51.6%vs 12.9%，P=0.003），是高度异型增生腺瘤敏感性的2倍以上（40.8%vs 14.1%，P<0.001），提示粪便DNA较粪便隐血试验能更敏感地检测早期CRC。Kalimutho等［27］使用定量变性高效液相色谱法检测K-Ras、APC、p53和 BRAF基因量化粪便DNA完整性状态，结果显示，4个基因扩增分析提高了对单基因扩增、钙卫蛋白评估或免疫法粪便隐血试验（immune fecal occultbloodtest，IFOBT）的敏感性。

3.2 SFRP和WIF-1基因

张虎等［28］研究发现粪便中 SFRP1、SFRP2、SFRP5和WIF-1基因在CRC及腺瘤中均被甲基化，在CRC中的甲基化率分别为68.8%、56.3%、45.8%和60.4%，高于腺瘤和增生性息肉。联合检测4种粪便基因甲基化，CRC和腺瘤的检出率提高，敏感性高达81.8%，特异性为93.3%，明显高于粪便隐血试验。Aguilera等［29］研究发现，在整个CRC发生过程中出现SFRP1、SFRP2和WIF-1基因甲基化相关沉默，提示粪便中Wnt拮抗基因甲基化可能成为筛查早期结直肠癌非侵入性的生物学标志物。

3.3 BMP3、NDRG4、TFPI2、vimentin 和 SFRP2 基因

有研究联合检测 NDRG4、BMP3、TFPI2和vimentin 4个甲基化基因，CRC的检出率为85%，肿瘤直径≥1 cm的腺瘤患者检出率为54%，特异性为90%［30］。Imperiale 等［31］应用高甲基化 NDRG4、BMP3与K-Ras突变，发现粪便DNA检测CRC的敏感性为92.3%，特异性为86.6%，在检测晚期癌前病变方面优于IFOBT，但特异性较低。Park等［32］研究发现，甲基化的NDRG4、BMP3、TFPI2和SFRP2启动子在CRC样本中检测率分别为68.8%、40.0%、31.4%和60.0%，高于腺癌样本中的检出率，4个标志物联合检测CRC和腺癌的敏感性分别为94.3%和72.2%，但特异性较低。提示 NDRG4、BMP3、TFPI2 和 vimentin 或 SFRP2 基因联合检测，敏感性较高，但3个或4个甲基化标志物检测尚不足以用于人群CRC筛查，需进一步验证人群中这些标志物的甲基化，为CRC寻找新的标志物。

3.4 TMEFF2、MGMT和SFRP2基因

Johnson 等［33］研究 SFRP2、TMEFF2 和 MGMT 基因在CRC患者粪便样本中的甲基化状况，发现超甲基化的TMEFF2和单独MGMT仅显示中等敏感性和特异性，加入SFRP2分析后，诊断CRC和癌前病变的敏感性增加到93.7%。有研究发现，超甲基化的SFRP2诊断高度发育不良腺瘤的敏感性为46.0%～66.7%，亦提示其在CRC早期发展中的作用［34］。由此认为，联合检测TMEFF2、MGMT和SFRP2基因可能对 CRC及其癌前病变诊断具有重要作用。

4 展望

CRC发病是结直肠细胞DNA中遗传和表观遗传学改变的逐渐积累，单基因突变或分子标志物改变常被用于CRC筛查，粪便DNA检测具有非侵入性、患者依从性好、高敏感性和高特异性等优点，但单基因检测的敏感性和特异性并不理想，多基因联合检测成为研究热点。然而，目前粪便DNA检测费用较高，检测技术亦尚不成熟，如何选择合理联合检测基因以提高CRC检测敏感性及特异性是面临的难题和挑战。相信随着该领域学者不懈努力以及分子生物技术不断发展，粪便DNA检测技术有望成为CRC早期诊断及筛查的重要辅助手段。